[發(fā)明專利]一種用于基因組二代測序的核酸樣品含量測定方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910013851.2
• 申請日: 2019-01-08
• 公開（公告）號: CN109868310A
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳釧;侯玉彬;向浩;張露露
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢至純科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 武漢臻誠專利代理事務(wù)所(普通合伙) 42233
• 代理人: 胡星馳

本發(fā)明公開了一種用于基因組二代測序的核酸樣品含量測定方法包括以下步驟：(1)對一個或多個給定濃度標(biāo)準(zhǔn)品以及待測核酸樣品，進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得給定熒光強(qiáng)度下標(biāo)準(zhǔn)品及待測核酸樣品的循環(huán)次數(shù)；(2)根據(jù)步驟(1)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)次數(shù)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線系列中選擇適用的標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)根據(jù)步驟(1)中獲得的待測核酸樣品的循環(huán)次數(shù)和步驟(2)選擇的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)定待測核酸樣品的濃度。本發(fā)明通過選擇實(shí)驗(yàn)條件與當(dāng)次實(shí)驗(yàn)較為一致的比較準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線，能顯著降低定量誤差，提高定量準(zhǔn)確性。同時優(yōu)選方案能顯著減少標(biāo)準(zhǔn)品用量，節(jié)省耗材，降低定量成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因組測序技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種用于基因組二代測序的核酸樣品含量測定方法。

背景技術(shù)

隨著第二代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，科學(xué)界也開始越來越多地應(yīng)用第二代測序技術(shù)來解決生物學(xué)問題。第二代測序技術(shù)平臺的應(yīng)用，包括羅氏公司454測序平臺、ABI公司的Solid測序平臺，以及Illumina公司的Solexa測序平臺，他們對宏基因組的研究起到了重大影響。其中Illumina公司的Solexa和Hiseq應(yīng)該說是目前全球使用量最大的第二代測序機(jī)器。隨著二代測序的應(yīng)用越來越廣泛，測序文庫定量的問題隨之突顯：如果對于文庫的定量不夠準(zhǔn)確，最終測序完畢產(chǎn)出的數(shù)據(jù)量也會相應(yīng)的偏差。具體而言，如果核酸樣本含量較低，一次測序文庫所產(chǎn)出的數(shù)據(jù)量不夠，無疑是對測序耗材以及時間人力的浪費(fèi)；如果核酸樣本含量過高，甚至導(dǎo)致產(chǎn)出過多導(dǎo)致質(zhì)量很差以至于無法進(jìn)行生物信息學(xué)分析，即爆機(jī)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。

因此對于基因二代測序而言，用于基因組二代測序的核酸樣品含量測定問題非常關(guān)鍵，決定了。目前采用的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸含量測定方法是熒光定量法，目前的熒光定量法的結(jié)果準(zhǔn)確性受到許多不可控的因素的影響，包括環(huán)境溫度、人工移液精確度誤差、模板濃度過低、隨著PCR循環(huán)次數(shù)增多，會進(jìn)入平臺期，反應(yīng)進(jìn)入平臺期的時機(jī)和平臺期的高低都有很大變化,難以精確控制條件一致等等。因此目前的熒光定量法的準(zhǔn)確度無法滿足二代測序擴(kuò)增產(chǎn)物核酸含量測定的要求，經(jīng)常造成數(shù)據(jù)產(chǎn)出量不足或者數(shù)據(jù)報廢的問題。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進(jìn)需求，本發(fā)明提供了一種用于基因組二代測序的核酸樣品含量測定方法，其目的在于通過使用較為準(zhǔn)確的標(biāo)準(zhǔn)曲線替代當(dāng)次實(shí)驗(yàn)可能效果不好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此解決現(xiàn)有的用于基因二代測序的核酸樣品含量測定方法定量結(jié)果不準(zhǔn)確的技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種用于基因組二代測序的核酸樣品含量測定方法，包括以下步驟：

(1)對一個或多個給定濃度標(biāo)準(zhǔn)品以及待測核酸樣品，進(jìn)行熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，獲得給定熒光強(qiáng)度下標(biāo)準(zhǔn)品及待測核酸樣品的循環(huán)次數(shù)；

(2)根據(jù)步驟(1)中獲得的標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)次數(shù)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線系列中選擇適用的標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(3)根據(jù)步驟(1)中獲得的待測核酸樣品的循環(huán)次數(shù)和步驟(2)選擇的標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)定待測核酸樣品的濃度。

優(yōu)選地，所述用于基因組二代測序的核酸樣品含量測定方法，其步驟(2)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線系列中，各標(biāo)準(zhǔn)曲線體現(xiàn)初始濃度的對數(shù)和循環(huán)次數(shù)之間的線性關(guān)系；

優(yōu)選地，所述用于基因組二代測序的核酸樣品含量測定方法，其步驟(2)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線系列中，各標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)大于或等于0.99；所述各標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作標(biāo)準(zhǔn)一致。

優(yōu)選地，所述用于基因組二代測序的核酸樣品含量測定方法，其步驟(2)所述標(biāo)準(zhǔn)曲線系列中，各標(biāo)準(zhǔn)曲線按照如下方法制作：

(2-1)對于包括有效濃度范圍內(nèi)給定的濃度呈梯度的2個或2個以上的標(biāo)準(zhǔn)品，按照預(yù)設(shè)條件進(jìn)行熒光定量鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)，獲得給定熒光強(qiáng)度下各給定濃度標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)次數(shù)；

(2-2)通過最小二乘法對步驟(2-1)中獲得的循環(huán)次數(shù)及給定的對數(shù)值擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算所述標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)；