[發(fā)明專利]一種細(xì)胞凍存液

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910010190.8
• 申請(qǐng)日: 2019-01-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111406736A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-07-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張海峰;彭昉;俞英豪;張孝松;陸誠(chéng)
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州可典生物科技有限公司;杭州中贏生物醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

本發(fā)明公開(kāi)了一種細(xì)胞凍存液，主要成分為二甲基亞砜、右旋糖酐、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀，利用本發(fā)明提供的細(xì)胞凍存液可用于凍存干細(xì)胞、臍帶血、普通細(xì)胞等，同時(shí)該凍存液具有成本低、細(xì)胞存活率高、成分簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于生物醫(yī)學(xué)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種細(xì)胞凍存液，具體涉及一種用于干細(xì)胞的凍存液。

背景技術(shù)

臍帶血是胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液，通常是廢棄不用的。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)，臍帶血中含有可以重建人體造血和免疫系統(tǒng)的造血干細(xì)胞，可用于造血干細(xì)胞移植，治療80多種疾病。因此，臍帶血已成為造血干細(xì)胞的重要來(lái)源，特別是無(wú)血緣關(guān)系造血干細(xì)胞的來(lái)源。也是一種非常重要的人類生物資源。

干細(xì)胞治療是將具有不斷自我繁殖能力和多向化潛能的干細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，再將其移植入患者受損或缺損組織中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)損傷組織的補(bǔ)充和修復(fù)。

目前干細(xì)胞采集后，需要加入保存液進(jìn)行冷凍保存，細(xì)胞凍存液是細(xì)胞凍存過(guò)程中的核心試劑，關(guān)系到細(xì)胞復(fù)蘇后的活性及數(shù)量等問(wèn)題，現(xiàn)有的細(xì)胞凍存液，一方面營(yíng)養(yǎng)成分單一，配比不當(dāng)，導(dǎo)致細(xì)胞存活率低、穩(wěn)定性差；另一方面大多都是異種血清，會(huì)引入外源蛋白從而增加細(xì)胞污染和過(guò)敏的風(fēng)險(xiǎn)，不適用于臨床。

因此，為有效開(kāi)展干細(xì)胞移植及建立干細(xì)胞庫(kù)，亟需開(kāi)發(fā)一種成本低、細(xì)胞存活率高、成分簡(jiǎn)單的細(xì)胞凍存液，對(duì)于生物醫(yī)學(xué)具有重要的研究與應(yīng)用價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞凍存液，使凍存培養(yǎng)后的細(xì)胞具有成活率高的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)滿足凍存液成分簡(jiǎn)單、成本低等要求。

本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)上述目的。

第一方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞凍存液，所述細(xì)胞凍存液的成分如下：

將上述組分加入到工業(yè)用水中，用于配置得到細(xì)胞凍存液。

該細(xì)胞凍存液采用聯(lián)合滲透性和非滲透性保護(hù)液組合方案，細(xì)胞凍存液在完全凝固之前，滲透到細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度，降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度，從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷，同時(shí)細(xì)胞內(nèi)水分也不會(huì)過(guò)分外滲，避免細(xì)胞過(guò)分脫水皺縮。

第二方面，本發(fā)明提供了一種細(xì)胞凍存液的使用方法，所述方法包括如下步驟：

1)凍存液制備：制備本發(fā)明第一方面所述的細(xì)胞凍存液，將各組分按照常規(guī)的操作方法及相應(yīng)的比例混合即可獲得；

2)細(xì)胞懸液制備：

a.將培養(yǎng)細(xì)胞用0.04％乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA·2Na)或0.29％胰蛋白酶消化3～7min(根據(jù)室溫情況而定)，至光鏡下見(jiàn)到貼壁細(xì)胞間出現(xiàn)篩狀間隙為止，棄去消化液，加PBS液；

b.用吸管將細(xì)胞從瓶壁上輕輕吹打下來(lái)，并移入離心管中；

c.800～1000r/min，短時(shí)低速離心5min；

d.棄上清，加pH 7.4的PBS液5～8ml，低速短時(shí)離心，800～1000r/min 離心3～5min；重復(fù)2～3次，以去除細(xì)胞懸液中的細(xì)胞碎片；

e.加少許PBS液，將沉淀細(xì)胞輕輕吹打均勻；加固定液或低溫保存待用。

3)根據(jù)細(xì)胞懸液的體積，按一定比例以穩(wěn)定速率加入細(xì)胞凍存液并充分混勻；

4)凍存：將步驟3)中充分混勻的細(xì)胞溶液分裝至凍存管中，并轉(zhuǎn)移至液氮中，進(jìn)行程序性降溫至-80℃并轉(zhuǎn)至液氮中儲(chǔ)存；

5)細(xì)胞復(fù)蘇：