[發(fā)明專利]一種FnCpf1突變體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910008859.X
• 申請(qǐng)日: 2019-01-04
• 公開（公告）號(hào): CN109678939B
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅云孜;王麗蘋;王浩君
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)華西醫(yī)院
• 主分類號(hào): C07K14/195
• 分類號(hào): C07K14/195;C12N15/70;C12N1/21
• 代理公司: 成都高遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發(fā)明提供了一種FnCpf1其突變體，它是在野生型FnCpf1基礎(chǔ)上，經(jīng)過氨基酸位點(diǎn)突變得到，所述野生型FnCpf1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述突變的位點(diǎn)包含Asn607、Lys180、Lys660、Asp616中的至少一個(gè)突變。本發(fā)明FnCpf1突變體的是識(shí)別序列更多，應(yīng)用范圍更廣。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種FnCpf1突變體。

背景技術(shù)

二型限制限制性內(nèi)切酶(RE)的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了DNA重組技術(shù)的廣泛應(yīng)用。隨后,合成生物學(xué)的飛速發(fā)展觸發(fā)了對(duì)靈活多用的體外DNA組裝/編輯策略的需求。迄今,體外DNA組裝/編輯方法可分為兩類:酶切連接和同源序列引導(dǎo)的同源重組。目前,最常用的酶切連接主要包括傳統(tǒng)的基于限制性內(nèi)切酶的酶切連接和Golden Gate組裝。Golden Gate是基于IIS的限制性內(nèi)切酶的一步克隆方法，并已優(yōu)化用于多片段DNA的按序組裝(Werner,Engler etal.2012)。但是，對(duì)于既定的DNA序列，IIS內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)分布的不確定性和其存在數(shù)量的有限性，其編輯會(huì)受到限制。對(duì)于基于同源重組的體外編輯方法而言，例如Gibson組裝，片段數(shù)的增加或者片段中高GC序列的出現(xiàn)，編輯效率均會(huì)受到影響而下降。另外，由于其序列依賴性，我們無法實(shí)現(xiàn)對(duì)于高相似序列的重復(fù)編輯，例如將同一個(gè)啟動(dòng)子重復(fù)引入至目標(biāo)基因的不同位置。這些編輯方法中存在的限制也強(qiáng)調(diào)了對(duì)于開發(fā)新方法的需求性和重要性。

快速增長(zhǎng)的技術(shù)-規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)(CRISPR)系統(tǒng)近幾年發(fā)展迅速，其中最廣泛應(yīng)用的CRISPR系統(tǒng)是來自于化膿鏈球菌的CRISPR/Cas9。該系統(tǒng)在研究者的設(shè)計(jì)和優(yōu)化下，被用于輔助體外的分子克隆。但是，這些方法都是利用同源重組的方法將cas9剪切產(chǎn)生的平末端與目標(biāo)載體相連，所以對(duì)于序列高相似性的DNA片段的編輯往往會(huì)受到一定的局限。

2015年，張鋒等發(fā)現(xiàn)并鑒定了一種新的第二類V型的系統(tǒng)CRISPR-Cpf1，隨后研究者發(fā)現(xiàn)并證明了其在多種有機(jī)體中的應(yīng)用潛能和價(jià)值。相比于cas9的體外編輯，Cpf1具有以下優(yōu)勢(shì)：1)Cpf1剪切雙鏈DNA產(chǎn)生粘性末端；2)Cpf1的引導(dǎo)不需要反向作用的RNA,所以引導(dǎo)crRNA的長(zhǎng)度更短(～42bp)；3)Cpf1可以自己加工crRNA簇形成單個(gè)成熟的crRNA,使其易于開發(fā)用于多基因編輯。因此，基于Cpf1的體外編輯方法可以為cas9的應(yīng)用提供另一種選擇性。

在眾多已經(jīng)鑒定的Cpf1蛋白中，來源于Francisella novicida的FnCpf1具有一個(gè)明顯的優(yōu)勢(shì)-FnCpf1識(shí)別的PAM較短(3bp),并且當(dāng)間歇序列的長(zhǎng)度為23bp時(shí)，特異性的剪切PAM遠(yuǎn)端的第18個(gè)堿基和互補(bǔ)鏈的第23堿基，產(chǎn)生5bp的粘性末端。由于Cpf1的剪切由crRNA(識(shí)別的間歇區(qū)通常為23bp)介導(dǎo),相同的DNA序列出現(xiàn)的概率大大減少，因此很好的規(guī)避了識(shí)別位點(diǎn)非理想帶來的限制。綜上，F(xiàn)nCpf1介導(dǎo)的體外DNA編輯方法可以解決很多現(xiàn)有技術(shù)上的缺陷，但是FnCpf1識(shí)別范圍限定于TTN，使用范圍仍然有限。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決前述問題，本發(fā)明提供了一種識(shí)別范圍更廣的Cpf1突變體。

本發(fā)明FnCpf1突變體，它是在野生型FnCpf1基礎(chǔ)上，經(jīng)過氨基酸位點(diǎn)突變得到，所述野生型FnCpf1的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述突變的位點(diǎn)包含Asn607、Lys180、Lys660、Asp616中的至少一個(gè)突變。

其中，它包含Asn607Arg、Lys180Ser、Lys660Arg、Asp616Asn的至少一個(gè)突變。

Asn607Arg，是指野生型FnCpf1第607位的氨基酸Asn突變成為了Arg，其余突變的解釋方式相同。

其中，它還包含Lys671Arg突變、Lys613Val和/或Asn617Arg突變。

其中，它的氨基酸序列為SEQ ID NO：2或3所示。