[發(fā)明專利]一種FnCpf1介導的體外DNA編輯試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910008855.1
• 申請日: 2019-01-04
• 公開（公告）號: CN109593763B
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 羅云孜;王麗蘋;王浩君
• 申請（專利權(quán)）人: 四川大學華西醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90
• 代理公司: 成都高遠知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.一種基于CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的體外DNA編輯試劑盒，其特征在于：它含有如下組分：

DNA片段1、DNA片段2、CrRNA模板DNA與T7 RNA聚合酶；還含有Cpf1酶、RNase抑制劑、T4DNA連接酶；所述Cpf1酶為氨基酸序列為SEQ ID NO：3所示的Cpf1突變體；

其中：DNA片段1由a、b、c三段串聯(lián)組成，a、c段分別為CrRNA的識別切割區(qū)；b段為待拼接的核酸序列1；

CrRNA的識別切割區(qū)為PAM位點和長度為23bp的任意序列連接而成；

DNA片段2由d、e、f三段串聯(lián)組成，其中，e段為待拼接的核酸序列2，d、f段分別為CrRNA的識別切割區(qū)，d、f剪切后的末端分別與a、c互補；

CrRNA模板DNA：由T7啟動子、DR、spacer序列組成，DR為19或36nt，spacer序列長度為23nt；

T7啟動子序列：GAAATTAATACGACTCACTATAGG；

19nt的DR序列：AATTTCTACTGTTGTAGAT；

36nt的DR序列：GTCTAAGAACTTTAAATAATTTCTACTGTTGTAGAT。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：DNA片段1、2均可以是環(huán)狀質(zhì)粒或線性DNA；

CrRNA模板DNA的條數(shù)為1條以上，spacer序列分別與a、c、d、f的23nt長度識別區(qū)一致。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：它還含有T7 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑，所述相關(guān)試劑包含轉(zhuǎn)錄buffer和NTP(A+U+C+G)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：轉(zhuǎn)錄buffer包含下述組分：100mM pH8.0的Tris-HCl、10mM MgCl₂、30mMDTT、2mM亞精胺、10％二甲亞砜。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述T7 RNA聚合酶及轉(zhuǎn)錄相關(guān)試劑來源于基于T7 RNA聚合酶的體外高效轉(zhuǎn)錄試劑盒。

6.權(quán)利要求1-5任意一項所述的試劑盒在基因編輯中的用途。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于：所述基因編輯包含基因敲除、基因突變、靶向基因激活/抑制、DNA連接、DNA多片段組裝、DNA片段插入、DNA片段替換、堿基替換。

8.一種基于CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的DNA連接方法，其特征在于：使用權(quán)利要求1-5任意一項所述的試劑盒進行連接，步驟如下：

(1)制備反應(yīng)體系：每20μl體系中，包含如下組分：

余量為RNase free H₂O；

(2)進行如下反應(yīng)程序：

a、37℃，1h-8h

b、37℃，5-10min

c、16℃，5-10min

d、重復(fù)b和c步驟6-15次；

e、50℃，10min；

f、65℃，10min。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA連接方法，其特征在于：DNA片段1為環(huán)狀載體，DNA片段2為線性化的插入片段；a步驟中為1h-4h。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的DNA連接方法，其特征在于：步驟如下：

(1)制備反應(yīng)體系：每20μl體系中，包含如下組分：

余量為RNase free H₂O；

(2)進行如下反應(yīng)程序：

a、37℃，1h或2h

b、37℃，10或5min

c、16℃，10或5min

d、重復(fù)b和c步驟6或12次；

e、50℃，10min；

f、65℃，10min。