[發(fā)明專利]一種用于批量制備微量細(xì)胞裂解液的保存方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910004299.0
• 申請日: 2019-01-03
• 公開（公告）號: CN110229777B
• 公開（公告）日: 2021-02-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李明振;劉浩
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州百凌生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/00
• 分類號: C12N5/00
• 代理公司: 杭州宇信知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 33231
• 代理人: 張宇娟

本發(fā)明為一種用于批量制備微量細(xì)胞裂解液的保存方法，包括如下步驟：(1)將甘油、DMSO或兩者的混合物加入到Trizol或者TCL buffer裂解液中并混勻；(2)用含上述添加劑的Trizol或者TCL buffer裂解液按一定體積加入到96孔板或者384孔板中裂解細(xì)胞或者組織，必要時用移液器吹打或其他工具進(jìn)行混勻；(3)迅速將細(xì)胞或者組織裂解液的孔板放在?20℃～80℃冰箱保存；(4)在保存一段時間后，將細(xì)胞或組織裂解液孔板從冰箱中取出，溶解后吸取細(xì)胞或組織裂解液進(jìn)行RT?PCR；(5)通過電泳檢測。該方法通過單獨(dú)添加不同比例的甘油或者不同比例的DMSO，或者以不同比例將甘油和DMSO混合后再添加的方法，解決了結(jié)晶和污染的問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物科技領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明報道了一種用于批量制備微量細(xì)胞裂解液的保存方法及其應(yīng)用，以便后續(xù)從中提取核酸用于開發(fā)重組單克隆抗體。

背景技術(shù)

核酸是分子生物學(xué)研究中核心材料，是基因信息的載體。因此制備和保存核酸是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。核酸中的信使RNA(mRNA)是攜帶遺傳信息并能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一類單鏈核糖核酸，在遺傳信息的傳遞過程尤其是從核酸到蛋白的翻譯過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。但是，信使RNA由于是以單鏈形式存在非常不穩(wěn)定，并且容易受到環(huán)境中RNAase(核糖核酸酶)的污染和降解。因此，在實(shí)驗(yàn)中需要盡快將細(xì)胞或者組織進(jìn)行處理，破壞掉細(xì)胞或組織中內(nèi)源性的RNAase(核糖核酸酶)，防止信使RNA被降解。

現(xiàn)在普遍采用的細(xì)胞裂解和保存的方法主要是Trizol或在其基礎(chǔ)上改進(jìn)的其他方法，比如Qiagen的TCL buffer(Qiagen Cat No./ID:1031576；Cat No./ID:1070498)。Trizol和TCL buffer的主要成分是異硫氰酸胍(guanidine thiocyanate，GITC)和苯酚(USpatents 4,843,155and 5,346,994)。使用時將Trizol或TCL buffer與細(xì)胞或組織以一定比例混合，或直接進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或低溫(-20℃～80℃)保存。

現(xiàn)代生物科技工業(yè)化進(jìn)程已經(jīng)發(fā)展到自動化和高通量的階段，樣品多樣性豐富，但樣品量稀少。這些樣品大多少被保存在96孔板或者384孔板，以滿足自動化和高通量的需求。在另一發(fā)明《一種快速高效分離單個抗原特異性B細(xì)胞的方法》(申請?zhí)?01610724209.1)中公開了一種高通量分離B細(xì)胞的方法，通過該方法分離得到的B細(xì)胞種類多、數(shù)量少，為了滿足高通量的要求需要將B細(xì)胞保存在96孔板或者384孔板中。

由于Trizol的中的異硫氰酸胍和其他成分，比如SDS的存在，導(dǎo)致在低溫環(huán)境中細(xì)胞或組織裂解液部分或者全部產(chǎn)生結(jié)晶。當(dāng)這種細(xì)胞或組織裂解液以微量形式存在時，比如96孔板或者384孔板，由于孔板的密封性較低、空間距較小，這種結(jié)晶會生長并延申到相鄰孔，從而導(dǎo)致相鄰孔的裂解液交叉污染。從而導(dǎo)致假陽性或者假陰性，給科研和生產(chǎn)帶來非常大的困擾。因此，急迫需要解決這種低溫下裂解液結(jié)晶的問題，使科研和生產(chǎn)活動更加高效和可靠。

甘油是一種有機(jī)物，化學(xué)名為丙三醇，國家標(biāo)準(zhǔn)稱為甘油，無色、無臭、味甜，外觀呈澄明黏稠液態(tài)。化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、安全無毒，常用于醫(yī)療、食品和化妝品中，起到吸濕、潤滑和防凍等做用。

DMSO是一種含硫有機(jī)物，化學(xué)名為二甲基亞砜，常溫下為無色無臭的透明液體。化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可以和水以及絕大多數(shù)有機(jī)溶劑互溶，被譽(yù)為“萬能溶劑”。純DMSO的冰點(diǎn)是18.45℃，含水40％的DMSO在-60℃不凍，在醫(yī)療上常用于骨髓、血液、低溫保存的防凍劑等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明針對細(xì)胞或組織裂解液在低溫保存條件下會產(chǎn)生結(jié)晶造成孔間污染的問題，提供一種用于細(xì)胞或組織裂解和保存的方法，該方法通過單獨(dú)添加不同比例的甘油或者不同比例的DMSO，或者以不同比例將甘油和DMSO混合后再添加的方法，解決了結(jié)晶和污染的問題。

本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種用于批量制備微量細(xì)胞裂解液的保存方法，包括如下步驟：