[發(fā)明專利]一種培育高結(jié)瘤固氮轉(zhuǎn)基因植物的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201910003815.8
• 申請(qǐng)日: 2019-01-03
• 公開（公告）號(hào): CN109852634B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王幼寧;李沅芹;曹金山;李國紀(jì);李霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;C12N15/11;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/54
• 代理公司: 石家莊輕拓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 13128
• 代理人: 張培元

本發(fā)明公開了一種培育高結(jié)瘤固氮轉(zhuǎn)基因植物的方法，在植物體內(nèi)過表達(dá)序列表中的SEQ ID NO：1所示核苷酸序列，獲得與正常植物相比具有高結(jié)瘤固氮能力的轉(zhuǎn)基因植物。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，利用本發(fā)明構(gòu)建的過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化受體大豆植株獲得轉(zhuǎn)基因植物，能夠顯著提高大豆的結(jié)瘤固氮能力，對(duì)提高大豆產(chǎn)量具有重大的實(shí)際意義。本發(fā)明的技術(shù)方案在基礎(chǔ)科研和農(nóng)林應(yīng)用兩個(gè)方面均具有實(shí)際價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種能夠提升植物結(jié)瘤固氮能力的基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

大豆起源于中國，是我國重要的經(jīng)濟(jì)糧油作物。大豆作為豆科植物，具有特殊的根部側(cè)生器官根瘤。大豆可以通過和根瘤菌互利合作進(jìn)行共生固氮，將空氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為可供植物吸收利用的氮素營養(yǎng)，既減少氮肥的施用量又保證了大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)。因此共生固氮是維持大豆高產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)的一種重要性狀。

現(xiàn)有技術(shù)中，已存在諸多通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高大豆結(jié)瘤固氮能力的研究。但是尚沒有關(guān)于GH3介導(dǎo)大豆共生固氮菌植互作過程機(jī)理的報(bào)道。本研究開發(fā)了一個(gè)與既往基因類群不同的全新的方向。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種培育高結(jié)瘤固氮轉(zhuǎn)基因植物的方法

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。

一種培育高結(jié)瘤固氮轉(zhuǎn)基因植物的方法，在植物中過表達(dá)SEQ ID NO：1所示的基因，培育出具高結(jié)瘤固氮能力的轉(zhuǎn)基因植物。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，首先構(gòu)建含有SEQ ID NO：1所示基因的重組過表達(dá)載體，然后利用此重組過表達(dá)載體構(gòu)建轉(zhuǎn)化體，再利用此轉(zhuǎn)化體侵染目的植物，篩選得到與正常植物相比具有高結(jié)瘤固氮能力的轉(zhuǎn)基因植物。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述重組過表達(dá)載體的空載體為pTF101質(zhì)粒。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，利用限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I將SEQ IDNO：1所示基因連接到空載體上構(gòu)建重組過表達(dá)載體。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述轉(zhuǎn)化體為農(nóng)桿菌。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，所述目的植物為大豆。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，該方法包含如下步驟：

A、構(gòu)建含有SEQ ID NO：1所示基因的重組表達(dá)載體：

A-1、首先以大豆葉片DNA為模板，擴(kuò)增獲得SEQ ID NO：1所示多核苷酸序列并連接至T載體上，然后用限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I酶切所得T載體質(zhì)粒，回收酶切產(chǎn)物；

A-2、用限制性內(nèi)切酶Xba I和BamH I酶切空載體pTF101質(zhì)粒，回收載體骨架；

A-3、用T4連接酶將步驟A-1的酶切產(chǎn)物和步驟A-2的載體骨架連接，連接產(chǎn)物熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α菌株，37℃過夜培養(yǎng)，挑取陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證，得到重組表達(dá)載體。

B、采用液氮凍溶法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌制備轉(zhuǎn)化體：

B-1、取出凍存的200 μL 感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞，融化后加入5-10 μL步驟A所得重組表達(dá)載體的質(zhì)粒DNA，輕彈管壁混勻，冰上靜置20-30 min；

B-2、上步所得放入液氮中5 min后取出，轉(zhuǎn)入37℃、5 min 融化后，加入800 μLYEP液體培養(yǎng)基，28℃ 低速振蕩、150 rpm，4-5 h；