[發(fā)明專利]具有選擇性抗大腸桿菌活性的抗菌肽及其活性優(yōu)化修飾物

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201910001604.0
• 申請日: 2019-01-02
• 公開（公告）號: CN109627314A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 吳志宏
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江亮肽生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/22;C07K1/20;A61P31/04;A01P1/00
• 代理公司: 杭州裕陽聯(lián)合專利代理有限公司 33289
• 代理人: 姚宇吉

1.具有選擇性抗大腸桿菌活性的抗菌肽，其特征在于，抗菌肽是具有選擇性抑制大腸桿菌活性的人源天然蛋白，所述抗菌肽的氨基酸序列由63個(gè)氨基酸殘基組成，其氨基酸序列為

SEQ ID NO.1；

SEQ ID NO.1:

KQTKQMVDCSHYKKLPPGQQRFCHHMYDPICGSDGKTYKNDCFFCSKVKKTDGTLKFVHFGKC。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有選擇性抗大腸桿菌活性的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽從人體足跟角質(zhì)層腳屑中提取、分離、純化得到。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的具有選擇性抗大腸桿菌活性的抗菌肽，其特征在于，

所述提取的過程為：

收集人體足跟角質(zhì)層腳屑，采用酸性乙酰乙酸緩沖液提取總蛋白；

所述分離、純化的過程為：

提取的總蛋白經(jīng)超濾管以三羥甲基氨基甲烷檸檬酸鹽緩沖液膜滲濾后,用肝素瓊脂糖凝膠柱進(jìn)行親和層析；

附著肝素的蛋白先通過含氯化鈉的三羥甲基氨基甲烷檸檬酸鹽緩沖液洗脫，再用三氟乙酸進(jìn)行膜滲濾；

滲出液通過制備柱以反向高效液相色譜方式進(jìn)行分離純化,富集的蛋白經(jīng)冷凍干燥后溶解于乙酸水溶液中保存；

富集的蛋白通過制備柱以反向高效液相色譜方式進(jìn)行再一次分離純化,分別收集各個(gè)峰值區(qū)的蛋白并用質(zhì)譜儀進(jìn)行分子量鑒定和氮末端蛋白測序；蛋白分子量為7314.5，7186.4，7168.3，7058.2，6957.1，6828.9，6810.9，6700.8或6569.6道爾頓的，都是抗菌肽或其衍生物。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有選擇性抗大腸桿菌活性的抗菌肽，其特征在于，所述抗菌肽抑制ATCC 11303、ATCC 10536、ATCC 11229大腸桿菌株系的抑菌圈直徑大于等于10.5mm。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的具有選擇性抗大腸桿菌活性的抗菌肽，其特征在于，環(huán)境的PH值對殺菌效率具有影響。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的具有選擇性抗大腸桿菌活性的抗菌肽，其特征在于，酸性環(huán)境條件下殺菌效率高，PH值越低效率越高。

7.具有選擇性抗大腸桿菌活性的抗菌肽的活性優(yōu)化修飾物，其特征在于，所述抗菌肽的活性優(yōu)化修飾物為SPINK9-RV，SPINK9-RV的氨基酸序列為SEQ ID NO.2；

SEQ ID NO.2:

KQTKQMVDCSHYKKLPPGQQRFCHRVYDPICGSDGKTYKNDCFFCSKVKKTDGTLKFVHFGKC。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的具有選擇性抗大腸桿菌活性的抗菌肽的活性優(yōu)化修飾物，其特征在于，所述SPINK9-RV的修飾過程為：

突變方案為：His²⁵Met²⁶定點(diǎn)突變?yōu)锳rg²⁵Val²⁶，設(shè)計(jì)合成覆蓋突變位點(diǎn)的雙向引物，通過DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以搭橋法方式向目的DNA片段中引入點(diǎn)突變Arg²⁵Val²⁶。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的具有選擇性抗大腸桿菌活性的抗菌肽的活性優(yōu)化修飾物，其特征在于，當(dāng)大腸桿菌菌懸液的蛋白用量小于等于12.5μg/ml時(shí)，SPINK9不具有抗菌活性，修飾物SPINK9-RV具有抗菌活性。