[發明專利]用于切割SSDNA以及檢測靶DNA的V型CRISPR/CAS效應蛋白

在審

• 申請號: 201880087246.3
• 申請日: 2018-11-20
• 公開（公告）號: CN111630163A
• 公開（公告）日: 2020-09-04
• 發明（設計）人: J·A·都納;J·S·陳;L·B·哈靈頓;E·馬
• 申請（專利權）人: 加利福尼亞大學董事會
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/11;C12Q1/6844
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 李程達

1.一種檢測樣品中的靶DNA的方法，所述方法包括：

(a)使所述樣品與以下物質接觸：

(i)V型CRISPR/Cas效應蛋白；

(ii)指導RNA，所述指導RNA包含：與所述V型CRISPR/Cas效應蛋白結合的區域和與所述靶DNA雜交的指導序列；和

(iii)為單鏈的且不與所述指導RNA的所述指導序列雜交的檢測劑DNA；以及

(b)測量由所述V型CRISPR/Cas效應蛋白切割所述單鏈檢測劑DNA而產生的可檢測信號，從而檢測所述靶DNA。

2.如權利要求1所述的方法，其包括使所述樣品與前體指導RNA陣列接觸，其中所述V型CRISPR/Cas效應蛋白切割所述前體指導RNA陣列以產生所述指導RNA和至少一個另外的指導RNA。

3.如權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述靶DNA是單鏈的。

4.如權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述靶DNA是雙鏈的。

5.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述靶DNA是病毒DNA。

6.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述靶DNA是乳多空病毒、嗜肝DNA病毒、皰疹病毒、腺病毒、痘病毒或細小病毒DNA。

7.如權利要求1-4中任一項所述的方法，其中所述V型CRISPR/Cas效應蛋白是Cas12蛋白。

8.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述V型CRISPR/Cas效應蛋白是Cas12a(Cpf1)或Cas12b(C2c1)蛋白。

9.如權利要求1-6中任一項所述的方法，其中所述V型CRISPR/Cas效應蛋白是Cas12d(CasY)或Cas12e(CasX)蛋白。

10.根據權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述樣品包含來自細胞裂解液的DNA分子。

11.根據權利要求1-10中任一項所述的方法，其中所述樣品包含細胞。

12.根據權利要求1-11中任一項所述的方法，其中所述接觸在體外、離體或體內的細胞內部進行。

13.根據權利要求12所述的方法，其中所述細胞是真核細胞。

14.根據權利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述靶DNA能夠以低至200fM的濃度被檢測到。

15.根據權利要求1-14中任一項所述的方法，其包括確定所述樣品中存在的所述靶DNA的量。

16.根據權利要求15所述的方法，其中所述確定包括：

測量所述可檢測信號以生成測試測量值；

測量由參考樣品或細胞產生的可檢測信號以生成參考測量值；以及

將所述測試測量值與所述參考測量值進行比較，以確定所述樣品中存在的靶DNA的量。

17.根據權利要求1-16中任一項所述的方法，其中測量可檢測信號包括以下一項或多項：基于金納米顆粒的檢測、熒光偏振、膠體相變/分散、電化學檢測和基于半導體的感測。

18.根據權利要求1-17中任一項所述的方法，其中所述單鏈檢測劑DNA包含熒光發射染料對。

19.根據權利要求18所述的方法，其中在所述單鏈檢測劑DNA被切割之前所述熒光發射染料對產生一定量的可檢測信號，并且在所述單鏈檢測劑DNA被切割之后所述可檢測信號的量減少。