[發(fā)明專利]用于根器官培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201880083256.X
• 申請(qǐng)日: 2018-12-21
• 公開（公告）號(hào): CN111757927A
• 公開（公告）日: 2020-10-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: M.布里爾曼;P.克勞特瓦舍爾;W.賴歇爾特;C.海威格
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 愛(ài)沃邏輯克技術(shù)有限責(zé)任公司
• 主分類號(hào): C12M1/00
• 分類號(hào): C12M1/00
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 余曉文;鄒宗亮

本發(fā)明涉及用于根器官培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器，其使得能夠在無(wú)菌環(huán)境之外進(jìn)行大部分接種或生物量轉(zhuǎn)移、培養(yǎng)物的培養(yǎng)和收獲。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)和無(wú)菌收獲根的方法，以及單獨(dú)或作為還包括接種容器或至少一個(gè)另外的生物反應(yīng)器的裝置的部分使用上述生物反應(yīng)器生產(chǎn)根培養(yǎng)物的方法。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于根器官培養(yǎng)物的生物反應(yīng)器，其使得能夠在無(wú)菌環(huán)境之外進(jìn)行大部分接種或生物量轉(zhuǎn)移、培養(yǎng)物的培養(yǎng)和收獲。本發(fā)明進(jìn)一步涉及生產(chǎn)和無(wú)菌收獲根的方法，以及單獨(dú)或作為還包括接種容器或至少一個(gè)另外的生物反應(yīng)器的裝置的部分使用上述生物反應(yīng)器生產(chǎn)根培養(yǎng)物的方法。

發(fā)明背景

根器官培養(yǎng)物的生產(chǎn)提供了獲取植物組織衍生化合物的途徑，而避免了從田間起源植物衍生化合物的常見弊端。在生物反應(yīng)器中，所有環(huán)境因素都可以在窄的范圍內(nèi)控制。該益處允許靈活、可再現(xiàn)且可預(yù)測(cè)的生物量收獲以衍生經(jīng)濟(jì)上相關(guān)的化合物，例如次生植物代謝物。根器官培養(yǎng)物通常不依賴于光合作用，并從培養(yǎng)基中隔離所有必需的營(yíng)養(yǎng)物。然而，根器官培養(yǎng)物可分為發(fā)根和不定根。

發(fā)根(hairy root)來(lái)源于用發(fā)根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)轉(zhuǎn)化的植物材料。轉(zhuǎn)化后，植物組織在細(xì)根中生長(zhǎng)，沒(méi)有進(jìn)一步分化成不同的組織類型。可以使用發(fā)根培養(yǎng)物，利用其一系列代謝途徑或植物來(lái)源，在液體培養(yǎng)物中產(chǎn)生高價(jià)值的次生植物代謝物。代謝物和其他有價(jià)值的產(chǎn)物包括染料、調(diào)味劑、農(nóng)藥和藥物。根器官培養(yǎng)物通常是遺傳穩(wěn)定的長(zhǎng)期培養(yǎng)物，并且發(fā)根培養(yǎng)物是特別有利的，這是由于發(fā)根表現(xiàn)出的快速生長(zhǎng)通常與懸浮的非植物真核細(xì)胞培養(yǎng)物的生長(zhǎng)速率相當(dāng)。重要的是，與這些其他懸浮培養(yǎng)物相反，發(fā)根培養(yǎng)物不需要對(duì)培養(yǎng)物添加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子。

然而，由于這些根的形態(tài)，大規(guī)模的發(fā)根培養(yǎng)存在一些問(wèn)題。具體來(lái)說(shuō)，發(fā)根具有正常植物根的主要形態(tài)特征，這意味著它們適合于在固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。因此，它們?cè)谝后w培養(yǎng)物中生長(zhǎng)時(shí)相互附著，并在液體培養(yǎng)基中伸長(zhǎng)生長(zhǎng)時(shí)形成致密的團(tuán)。由于這些根團(tuán)，在接種(生物反應(yīng)器生產(chǎn)過(guò)程的第一步)過(guò)程中就已經(jīng)出現(xiàn)處理發(fā)根培養(yǎng)物的困難。

原核或其他真核生物體的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物可以容易地在容器之間轉(zhuǎn)移以進(jìn)行接種，其中通過(guò)管和導(dǎo)管在容器或容器室之間的轉(zhuǎn)移幾乎不依賴于各自的生物量濃度。相反，隨著培養(yǎng)物生物量持續(xù)生長(zhǎng)，發(fā)根團(tuán)的大小增加。因此，就接種管、管和端口而言，用于接種較大培養(yǎng)物的接種物中較高的生物量濃度影響合適的接種容器和生物反應(yīng)器的技術(shù)設(shè)計(jì)方面。因此，從實(shí)驗(yàn)室到工業(yè)規(guī)模的培養(yǎng)規(guī)模擴(kuò)大，生長(zhǎng)形態(tài)極大限制了基于發(fā)根的生產(chǎn)過(guò)程的技術(shù)裝置的設(shè)計(jì)空間。

到目前為止，這些挑戰(zhàn)僅得到部分解決。實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)根培養(yǎng)物中使用的標(biāo)準(zhǔn)程序是手動(dòng)解剖根團(tuán)，隨后將所得的根塊手動(dòng)轉(zhuǎn)移至生物反應(yīng)器。因此，接種容器和生物反應(yīng)器通常在無(wú)菌環(huán)境，例如層流工作臺(tái)中開放以在不污染培養(yǎng)物的情況下手動(dòng)轉(zhuǎn)移根塊。然而，這種方法很難放大到工業(yè)生產(chǎn)體積。

Ramakrishnan et al.(1994,Biotechnology techniques 8(9):639-644)進(jìn)行了向用發(fā)根培養(yǎng)物接種生物反應(yīng)器的可放大解決方案的第一步。他們使用滅菌的攪拌器將預(yù)培養(yǎng)物的根勻漿化以制備接種物。然后將得到的漿液過(guò)濾，吸干并通過(guò)4L轉(zhuǎn)移容器通過(guò)使用壓縮空氣的正置換轉(zhuǎn)移到16.68L生物反應(yīng)器中。然而，切割、過(guò)濾、吸干和填充轉(zhuǎn)移容器的步驟都必須在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，這與手動(dòng)轉(zhuǎn)移一樣限制這種方法的可縮放性。

Wilson et al.(1990,Progress in Plant Cellular and Molecular Biology,pp.700-705；and WO 89/10958)能夠使用與500L生物反應(yīng)器頂部以凸緣連接的專用接種容器來(lái)接種500L中試規(guī)模生物反應(yīng)器。然而，該較小的接種容器的接種也必須在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，也在無(wú)菌環(huán)境中解剖根塊。除此之外，從500L擴(kuò)大到工業(yè)規(guī)模培養(yǎng)體積的問(wèn)題仍然難以捉摸，并且尚未報(bào)告針對(duì)反應(yīng)器接種目的的發(fā)根培養(yǎng)接種或轉(zhuǎn)移的可縮放解決方案。