[發(fā)明專利]使用烷基糖苷類進(jìn)行蛋白質(zhì)純化和病毒滅活

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201880082189.X
• 申請(qǐng)日: 2018-12-19
• 公開（公告）號(hào): CN111511756A
• 公開（公告）日: 2020-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: T·勃蘭特;H·梅茨納;C·霍恩;T·諾瓦克
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 康諾貝林倫瑙有限公司
• 主分類號(hào): C07K1/22
• 分類號(hào): C07K1/22;C07K1/16;A61L2/00
• 代理公司: 中國(guó)國(guó)際貿(mào)易促進(jìn)委員會(huì)專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 劉曉東

純化重組蛋白的方法，包括以下步驟：i)提供包含所述重組蛋白的溶液；ii)添加烷基糖苷到所述溶液中；和iii)純化所述重組蛋白。烷基糖苷的添加提供了對(duì)與過程相關(guān)的雜質(zhì)的清除改善。本發(fā)明的純化的重組蛋白具有低水平的宿主細(xì)胞DNA、宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)和病毒污染。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于重組表達(dá)多肽的領(lǐng)域，特別是這些多肽的純化以用于藥物用途。

背景技術(shù)

重組表達(dá)的多肽的大規(guī)模、經(jīng)濟(jì)的純化對(duì)于生物技術(shù)工業(yè)而言日益成為重要的問題。這些多肽是通過細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的，通常使用哺乳動(dòng)物、酵母或細(xì)菌細(xì)胞系，通過插入含有該多肽的基因的重組質(zhì)粒，所述細(xì)胞系經(jīng)工程改造以生產(chǎn)目的多肽。將所需多肽與細(xì)胞組分例如宿主細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)分離至足以用作人用治療劑的純度構(gòu)成一個(gè)艱巨的挑戰(zhàn)。理想地，所使用的純化技術(shù)將是可規(guī)模化的、有效的、具有成本效益的、可靠的，并且滿足最終產(chǎn)品的任何純度要求。當(dāng)前的純化技術(shù)通常涉及多次層析分離。典型的處理可能包括所有或至少一些以下步驟：沉淀，超濾，滲濾，免疫親和以及親和層析，陽(yáng)離子交換層析，陰離子交換層析，疏水相互作用層析，多元層析，金屬螯合層析和尺寸排阻層析。

使用重組技術(shù)，特別是用哺乳動(dòng)物細(xì)胞系制造的多肽也可能被病毒污染，包括對(duì)健康有害的病原性病毒。如果所述多肽將要施用于個(gè)體，則消除任何污染性病毒活性是重要的。當(dāng)前有許多不同的方法用于滅活病原性病毒，包括例如濕或干熱滅活、溶劑/去污劑(S/D)滅活、pH滅活、化學(xué)滅活和/或紫外線/γ射線滅活。在這些方法中，S/D滅活可能是使用最廣泛的殺病毒方法，因?yàn)閹缀跛兄匾娜祟惒≡w都是對(duì)溶劑和去污劑的膜破壞敏感的包膜病毒。在S/D滅活方法中，將有機(jī)溶劑和去污劑與包括被純化的多肽的流體混合和孵育。溶劑創(chuàng)造了促進(jìn)去污劑和包裹病毒的脂質(zhì)膜之間聚集的環(huán)境，而去污劑破壞了在該脂質(zhì)膜中分子之間的相互作用。一旦被破壞，包膜病毒不再結(jié)合并感染細(xì)胞，并且無法繁殖，因?yàn)橥暾闹|(zhì)膜對(duì)于這些活性至關(guān)重要。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)指南使用的典型條件是0.3％磷酸三正丁酯(TNBP)和1％聚山梨酯80(PS 80，也稱為聚氧乙烯(80)脫水山梨醇單油酸酯或80)在24℃孵育最少6個(gè)小時(shí)，或0.3％TNBP和1％聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)在24℃孵育最少4小時(shí)(參見參考文獻(xiàn)1)。

盡管S/D處理已成為滅活包膜病毒的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，但其應(yīng)用仍存在一些缺點(diǎn)。在產(chǎn)生最終產(chǎn)品之前，必須基本上去除制造期間添加的S/D混合物。例如，TNBP在所使用的濃度構(gòu)成健康風(fēng)險(xiǎn)，因此對(duì)于制造過程和最終產(chǎn)品而言是一個(gè)健康和安全問題。此外，常規(guī)使用的去污劑例如X-100構(gòu)成嚴(yán)重的環(huán)境威脅并不得不停用。這種病毒滅活步驟的加入還增加了處理時(shí)間，可能使產(chǎn)品產(chǎn)率降低多達(dá)10％(參見參考文獻(xiàn)2)，并且需要儀器在孵育期間攪動(dòng)混合物。為了最小化或消除這些問題，已經(jīng)提出了更簡(jiǎn)單、更有效的病毒滅活程序。常見的選擇涉及使用脂肪酸辛酸(辛酸酯)，例如在參考文獻(xiàn)2、3和4中提出的。在參考文獻(xiàn)5和6中描述了其他選擇。特別地，參考文獻(xiàn)6測(cè)試了建議在環(huán)境上更相容的多種去污劑。使用不同的去污劑對(duì)病毒滅活的效果是可變的。而且，盡管特定的去污劑可能能夠使病毒滅活，但是不能預(yù)測(cè)其對(duì)進(jìn)一步純化方法的影響，例如在DNA或宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)減少方面。

因此，需要純化重組表達(dá)的多肽的進(jìn)一步和改善的方法，尤其是實(shí)現(xiàn)減少的DNA和蛋白質(zhì)污染并滅活病原性病毒的方法。

發(fā)明內(nèi)容