[發明專利]基因位點飽和誘變(GSSM)方法

在審

• 申請號: 201880081803.0
• 申請日: 2018-12-18
• 公開（公告）號: CN111492063A
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: J·丹尼斯;R·蔡;譚敘秋
• 申請（專利權）人: 巴斯夫歐洲公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34;C12N15/10;C12Q1/686
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 陳迎春;黃革生

1.一種由包括標的蛋白質的編碼區的親本多核苷酸產生多個經過修飾的多核苷酸的方法，其中所述多個經過修飾的多核苷酸中的每個經過修飾的多核苷酸編碼經過修飾的多肽，所述經過修飾的多肽包括感興趣的蛋白質中的感興趣的第一氨基酸位置處的氨基酸取代，所述方法包括：

(a)提供能夠與所述親本多核苷酸的期望區域結合的多個引物，其中所述期望區域包括所述標的蛋白^\質的所述感興趣的第一位置處的氨基酸的密碼子，其中所述多個引物中的至少N個引物各自包括所述感興趣的第一氨基酸位置處的不同替代性氨基酸的第一密碼子，其中N是所述感興趣的第一位置處的期望氨基酸取代的數量；

(b)使所述多個引物與所述親本多核苷酸接觸以形成反應混合物；以及

(c)使所述反應混合物經歷聚合酶延伸反應以產生所述多個經過修飾的多核苷酸。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述多個引物中的至少一個引物包括所述替代性氨基酸之一的第二密碼子。

3.根據權利要求1所述的方法，其中所述多個引物包括至少兩個或更多個引物，所述至少兩個或更多個引物各自包括不同替代性氨基酸的第二密碼子。

4.根據權利要求1到3中任一項所述的方法，其中N是介于1與19之間的整數。

5.根據權利要求1到3中任一項所述的方法，其中N是19。

6.根據權利要求1到5中任一項所述的方法，其中所述多個多核苷酸包括對與所述標的蛋白質相比具有所述感興趣的第一氨基酸位置處的所有可能的標準氨基酸取代的多肽進行編碼的多核苷酸。

7.根據權利要求1到6中任一項所述的方法，其中所述多個引物不包括簡并引物。

8.根據權利要求1到7中任一項所述的方法，其進一步包括基于所述親本多核苷酸的所述期望區域的序列設計所述多個引物。

9.根據權利要求8所述的方法，其中所述多個引物中的至少一個引物能夠與位于所述感興趣的第一氨基酸位置處的所述氨基酸的所述密碼子上游20個核苷酸和下游20個核苷酸之間的區域結合。

10.根據權利要求1到9中任一項所述的方法，其進一步包括用限制酶處理步驟(c)中產生的所述多個經過修飾的多核苷酸，以去除所述親本多核苷酸。

11.根據權利要求1到10中任一項所述的方法，其進一步包括回收所述多個經過修飾的多核苷酸。

12.根據權利要求1到10中任一項所述的方法，其進一步包括將所述經過修飾的多核苷酸中的一個或多個經過修飾的多核苷酸引入到宿主細胞以表達所述標的蛋白質的一種或多種突變體。

13.根據權利要求12所述的方法，其中所述感興趣的第一氨基酸位置處的所述不同替代性氨基酸的所述引物中的所述密碼子中的至少一個密碼子是所述宿主細胞的優選密碼子。

14.根據權利要求12或13所述的方法，其進一步包括分析所述標的蛋白質的所述一種或多種突變體的穩定性、pH、產物抑制、耐鹽性、熱穩定性、底物特異性、活性、立體選擇性、表達或其組合。

15.根據權利要求14所述的方法，其進一步包括基于所述標的蛋白質的一種或多種突變體的穩定性、熱穩定性、底物特異性、活性、立體選擇性、表達、pH曲線變化(更高或更低的pH)、輔因子特異性、產物抑制、耐鹽性、對鹽濃度的敏感性、對鹽的敏感性、結合親和力或其組合來選擇所述一種或多種突變體。

16.根據權利要求12到15中任一項所述的方法，其中所述宿主細胞是真核細胞或原核細胞。