[發明專利]用于產生視網膜祖細胞的系統和方法

有效

• 申請號: 201880081377.0
• 申請日: 2018-10-17
• 公開（公告）號: CN111712564B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發明（設計）人: 卡爾·特里格瓦松;蔡慧岡;艾達·莫雷諾莫拉爾
• 申請（專利權）人: 新加坡國立大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61K35/30;A61P27/02
• 代理公司: 北京三高永信知識產權代理有限責任公司 11138
• 代理人: 關越

可以通過在其上具有層粘連蛋白基質的表面上分化人胚胎干細胞來產生視網膜祖細胞和成熟感光細胞，所述層粘連蛋白基質由兩種層粘連蛋白構成。一種層粘連蛋白是層粘連蛋白?521，另一種層粘連蛋白是層粘連蛋白?323或層粘連蛋白?523。可以使用多種細胞培養基來分化鋪在該基底上的干細胞，以獲得所述視網膜祖細胞和成熟感光細胞。

相關申請的交叉引用

本申請要求于2017年10月17日提交的PCT申請No.PCT/SG2017/050520的優先權，其通過引用完全并入。

背景技術

本公開涉及用于從人多能干細胞(human pluripotent stem cell)產生視網膜祖細胞(retinal progenitor cell)(例如感光細胞祖細胞(photoreceptor progenitorcell)或神經節祖細胞(ganglion progenitor cell))或視網膜感光細胞(retinalphotoreceptor cell)的系統和方法。還公開了用于這樣的系統和方法的組合物和基質。本文還公開并包括所得視網膜祖細胞或視網膜感光細胞的移植。這些方法、組合物和包含其的系統可用于治療眼病，例如黃斑變性(macular degeneration，MD)或色素性視網膜炎(retinitis pigmentosa，RP)。

在世界范圍內，失明的主要原因是年齡相關性黃斑變性(Age-related MacularDegeneration，AMD)和色素性視網膜炎(RP)。這兩種病癥涉及感光細胞和底部視網膜色素上皮(retina pigmented epithelium，RPE)的損失。感光細胞與RPE之間的功能性相互作用是支持視覺系統所必需的。不幸的是，人視網膜缺乏在細胞因疾病或損傷而損失時再生的能力，并且尚無有效治療來逆轉視網膜變性。

對于人細胞置換而言，認為有絲分裂后的人感光細胞并不是合乎倫理的合適來源，因為它們僅在妊娠19周之后才是可用的。對于來源于干細胞的感光細胞而言，現有方案主要通過使用基于在化學成分未確定的培養條件下的胚狀體自發分化來形成3D視杯或視網膜類器官。這些3D類器官不適合移植，并且這種方案產生了具有不同發育階段的異質視網膜細胞類型。

此外，Matrigel^TM是含有數種基底膜蛋白(例如IV型膠原、串珠蛋白聚糖(perlecan)、層粘連蛋白-111)以及生長因子和細胞內蛋白的鼠腫瘤提取物。因此，Matrigel^TM是異種的，受到批次間變化的影響，并且含有大量不明確組分。此外，在Matrigel^TM上培養的細胞還具有獲得非人N-羥乙酰神經氨酸(Neu5Gc)免疫原的可能性，這使得它們不適合臨床應用。

當前的治療包括口服藥物，其包括抗氧化劑(例如維生素A棕櫚酸酯)、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)、鈣通道阻斷劑和葉黃素/玉米黃質。然而，在視力恢復時都不顯示出有效性。

發明內容

本公開涉及用于獲得視網膜祖細胞或視網膜感光細胞的系統和方法。簡言之，在包含(i)層粘連蛋白-323(laminin-323，LN-323)或LN-523和(ii)層粘連蛋白-521的混合物的基底上培養多能干細胞。LN-323和LN-523先前從未被純化為純的形式，而是在人胚腎細胞(HEK-293)中作為重組人蛋白首次生產，并被純化以作為細胞培養包覆層。使用兩種不同的細胞培養基來使干細胞分化，以獲得視網膜祖細胞或視網膜感光細胞(取決于對它們進行分化的時間長度)。

還鑒定出五種不同的視網膜祖細胞亞群。這五種亞群可通過第26-34天(Day 26-34)基因譜(gene profile)來鑒定，如本文進一步解釋的。