[發明專利]具有高穩定性的可光裂解的核苷酸試劑

有效

• 申請號: 201880076192.0
• 申請日: 2018-11-27
• 公開（公告）號: CN111417645B
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發明（設計）人: C.阿納克萊托;A.古普塔;D.海因德爾;I.科茨洛夫;H.庫切爾邁斯特;A.尼爾思;C.韋爾納;S.G.威爾
• 申請（專利權）人: 豪夫邁·羅氏有限公司
• 主分類號: C07H19/10
• 分類號: C07H19/10;C07H19/20;C12Q1/6848;C12Q1/686
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 權陸軍;黃希貴

本發明提供了用于通過PCR和RT?PCR(逆轉錄酶?PCR)進行核酸擴增的穩定核苷酸試劑，其包含經修飾的核苷三磷酸。本發明還提供了在擴增反應中使用經修飾的核苷三磷酸檢測靶核酸序列在樣品中的存在或不存在的方法。

發明領域

本發明提供了穩定的核苷酸試劑、其制備方法、其使用方法以及包含它們的試劑盒。所述核苷酸試劑可用于許多重組DNA技術，尤其是通過聚合酶鏈反應(PCR)進行的核酸擴增。

發明背景

核酸擴增試劑一般包含溫度敏感組分，且因此必須經常在遠低于環境溫度的溫度貯藏和運輸。脫氧核苷三磷酸或其核糖核苷三磷酸類似物的情況尤其如此。這些試劑易于通過從末端喪失連續的磷酸基團而降解，從而導致二磷酸核苷和核苷一磷酸的形成，它們都不再作為核酸聚合酶的底物具有活性。通過酯化末端磷酸可以顯著提高核苷多磷酸的穩定性。例如，γ-甲基-dNTP類似物在足以完全降解正常dNTPs的熱應激條件下是完全穩定的。然而，末端磷酸的酯化可能會對這些核苷酸充當某些聚合酶的有效底物的能力具有負面影響。存在具有既是熱穩定的又最初作為底物無活性但容易通過簡單步驟活化的核苷三磷酸的需要。

發明概述

本發明提供了用于通過PCR和RT-PCR?(逆轉錄酶-PCR)進行核酸擴增的熱穩定核苷酸試劑，其包含具有可光裂解（photocleavable）部分的經修飾的核苷多磷酸。本發明還提供了在擴增反應中使用經修飾的核苷三磷酸檢測靶核酸序列在樣品中的存在或不存在的方法。

因此，在一個方面，本發明涉及一種檢測樣品中靶核酸序列的存在或不存在的方法，該方法包括進行擴增步驟，其包括使所述樣品與擴增試劑接觸以產生擴增產物，如果所述靶核酸序列存在于所述樣品中的話，和檢測所述擴增產物，其中所述擴增試劑包含具有可光裂解部分并具有以下結構的經修飾的核苷三磷酸：

其中堿基是嘌呤或嘧啶堿基或類似物。在一個實施方案中，在擴增步驟之前，用具有能夠裂解可光裂解部分的波長的光照射所述經修飾的核苷多磷酸。在一些實施方案中，所述擴增試劑包含核酸聚合酶、緩沖液、核苷三磷酸、至少一種寡核苷酸引物、可檢測地標記的寡核苷酸探針和/或染料中的至少一種。

在另一個方面，本發明涉及一種使用擴增試劑擴增靶核酸序列的方法，其中所述擴增試劑包含具有可光裂解部分并具有以下結構的經修飾的核苷三磷酸：

其中堿基是嘌呤或嘧啶堿基或類似物。在一個實施方案中，在擴增之前，用具有能夠裂解可光裂解部分的波長的光照射所述經修飾的核苷三磷酸。在一些實施方案中，所述擴增試劑包含核酸聚合酶、緩沖液、核苷三磷酸、至少一種寡核苷酸引物、可檢測地標記的寡核苷酸探針和/或染料中的至少一種。

在另一個方面，本發明涉及一種在擴增反應期間減少或防止核酸的非特異性擴增的方法，其包括提供用于擴增靶核酸的擴增試劑，其中所述擴增試劑包含具有可光裂解部分并具有以下結構的經修飾的核苷三磷酸：

其中堿基是嘌呤或嘧啶堿基或類似物。在一個實施方案中，在擴增之前，用具有能夠裂解可光裂解部分的波長的光照射所述經修飾的核苷三磷酸。在一些實施方案中，所述擴增試劑包含核酸聚合酶、緩沖液、核苷三磷酸、至少一種寡核苷酸引物、可檢測地標記的寡核苷酸探針和/或染料中的至少一種。

在另一個方面，本發明涉及一種組合物，其包含具有可光裂解部分并具有以下結構的經修飾的核苷三磷酸：

其中堿基是嘌呤或嘧啶堿基或類似物。在一個實施方案中，所述經修飾的核苷三磷酸的特征在于與未經修飾的核苷三磷酸相比具有更大的熱穩定性。在一些實施方案中，所述組合物進一步包含至少一種擴增試劑，其選自核酸聚合酶、緩沖液、核苷三磷酸、至少一種寡核苷酸引物、可檢測地標記的寡核苷酸探針和/或染料。