[發(fā)明專利]工程化的葡糖基轉(zhuǎn)移酶

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201880073175.1
• 申請(qǐng)日: 2018-09-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN111344400A
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-06-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李友根;E.D.賽穆克;M.S.佩尼;J.B.帕克;S.M.軒尼詩(shī);S.克拉里;V.阿爾坎;R.博特
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 納幕爾杜邦公司
• 主分類號(hào): C12N9/10
• 分類號(hào): C12N9/10;C12P19/04
• 代理公司: 中國(guó)專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 翟建偉;黃希貴

本文公開(kāi)了具有經(jīng)修飾的氨基酸序列的葡糖基轉(zhuǎn)移酶。此類工程化的酶合成具有增加的分子量的α?葡聚糖產(chǎn)物。進(jìn)一步公開(kāi)了使用工程化的葡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生α?葡聚糖的反應(yīng)和方法。

本申請(qǐng)要求美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?2/557,834(2017年9月13日提交)的權(quán)益，所述臨時(shí)申請(qǐng)通過(guò)引用以其全文并入本文。

技術(shù)領(lǐng)域

本公開(kāi)屬于酶催化領(lǐng)域。例如，本公開(kāi)涉及具有經(jīng)修飾的氨基酸序列的葡糖基轉(zhuǎn)移酶。此類經(jīng)修飾的酶合成具有增加的分子量的產(chǎn)物。

以電子方式提交的序列表的引用

所述序列表的官方副本經(jīng)由EFS-Web作為ASCII格式的序列表以電子方式提交，文件名為20180911_CL6159WOPCT_SequenceListing_ST25，創(chuàng)建于2018年9月11日，且具有約315千字節(jié)的大小，并與本說(shuō)明書(shū)同時(shí)提交。包含在所述ASCII格式的文件中的序列表是本說(shuō)明書(shū)的一部分并且以其全文通過(guò)引用并入本文。

背景技術(shù)

受到在多種應(yīng)用中使用多糖的期望所驅(qū)動(dòng)，研究人員已經(jīng)探索了可生物降解的、并且可以從可再生來(lái)源的原料節(jié)約地制造的多糖。一種這樣的多糖是α-1，3-葡聚糖，這種多糖是特征在于具有α-1，3-糖苷鍵的不溶性葡聚糖聚合物。例如，已經(jīng)使用從唾液鏈球菌(Streptococcus salivarius)分離的葡糖基轉(zhuǎn)移酶制備了這種聚合物(Simpson等人，Microbiology[微生物學(xué)]141：1451-1460，1995)。還例如，美國(guó)專利號(hào)7000000公開(kāi)了從酶促生產(chǎn)的α-1，3-葡聚糖制備紡成纖維。還研究了用于開(kāi)發(fā)新應(yīng)用或增強(qiáng)的應(yīng)用的多種其他葡聚糖材料。例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)2015/0232819公開(kāi)了具有混合的α-1，3鍵和α-1，6鍵的若干種不溶性葡聚糖的酶促合成。

雖然已經(jīng)在使用葡糖基轉(zhuǎn)移酶生產(chǎn)葡聚糖聚合物方面取得了這些進(jìn)展和其他進(jìn)展，但似乎很少關(guān)注增強(qiáng)由此類酶合成的不溶性葡聚糖產(chǎn)物的分子量。為解決這一技術(shù)差距，本文公開(kāi)了具有經(jīng)修飾的氨基酸序列的葡糖基轉(zhuǎn)移酶，該葡糖基轉(zhuǎn)移酶產(chǎn)生更高分子量不溶性葡聚糖產(chǎn)物。

發(fā)明內(nèi)容

在一個(gè)實(shí)施例中，本公開(kāi)涉及在與SEQ ID NO：62的氨基酸殘基Asn-531、Arg-534、Thr-563、Glu-567、Val-586、Gln-588、Ile-591、Lys-593、Ile-608、Ala-610、Leu-661、Arg-722、Thr-728、Met-732、Arg-741、Asn-743、Ala-777、Tyr-848或Ile-1453相對(duì)應(yīng)的位置處包含至少一個(gè)氨基酸取代的非天然葡糖基轉(zhuǎn)移酶，其中所述非天然葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成包含1，3-鍵的不溶性α-葡聚糖，并且所述不溶性α-葡聚糖的分子量高于由第二葡糖基轉(zhuǎn)移酶合成的不溶性α-葡聚糖的分子量，所述第二葡糖基轉(zhuǎn)移酶僅在一個(gè)或多個(gè)取代位置處不同于非天然葡糖基轉(zhuǎn)移酶。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本公開(kāi)涉及包含編碼如目前公開(kāi)的非天然葡糖基轉(zhuǎn)移酶的核苷酸序列的多核苷酸，任選地其中一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列可操作地連接到所述核苷酸序列，并且優(yōu)選地其中所述一個(gè)或多個(gè)調(diào)節(jié)序列包含啟動(dòng)子序列。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本公開(kāi)涉及反應(yīng)組合物，所述反應(yīng)組合物包含水、蔗糖和如目前公開(kāi)的非天然葡糖基轉(zhuǎn)移酶。

在另一個(gè)實(shí)施例中，本公開(kāi)涉及產(chǎn)生不溶性α-葡聚糖的方法，所述方法包括：(a)使至少水、蔗糖和如目前公開(kāi)的非天然葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸，從而產(chǎn)生不溶性α-葡聚糖；和(b)任選地，分離在步驟(a)中產(chǎn)生的不溶性α-葡聚糖。