[發明專利]單核苷酸分析方法及相關探針

在審

• 申請號: 201880069247.5
• 申請日: 2018-10-23
• 公開（公告）號: CN111263818A
• 公開（公告）日: 2020-06-09
• 發明（設計）人: 巴納比·巴姆福思;卡梅倫·亞歷山大·弗雷林
• 申請（專利權）人: 貝斯4創新公司
• 主分類號: C12Q1/6823
• 分類號: C12Q1/6823
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 高麗娜;張瑩

1.檢測分析物中給定的核苷三磷酸分子的核堿基是否包括給定化學或結構修飾的方法，其特征在于以下步驟：(1)在聚合酶存在下，使所述分析物與包含以下組分的生物探針反應：(a)一對單鏈第一寡核苷酸，其各自包含核酸外切酶封閉位點；位于所述封閉位點的5’側的至少一個限制性核酸內切酶識別位點；位于所述識別位點內的單個核苷酸捕獲位點以及分別位于所述識別位點5’側的第一和第二熒光團，所述第一和第二熒光團被布置為基本上不可檢測的，和(b)至少一個第二和任選地至少一個第三單鏈寡核苷酸，其各自與所述第一寡核苷酸分開并且能夠與所述對中的一個、另一個或兩個第一寡核苷酸的捕獲位點的3’和5’側的互補側翼區域雜交，以產生由(b1)和(b2)組成的使用的探針雙鏈體，其中，(b1)是所述對中的一個或另一個第一寡核苷酸，(b2)是包含所述第二寡核苷酸、源自所述核苷三磷酸分子的一個或其他個修飾的或未修飾的核苷酸以及任選地所述第三寡核苷酸的組分，其中所述雙鏈體包含四個可能的(b1)/(b2)雙鏈體排列中的一個；(2)將步驟(1)中產生的所述雙鏈體與限制性核酸內切酶系統反應，所述限制性核酸內切酶系統包含至少一種適合于選擇性地在所述識別位點切割所述(b1)鏈的限制性核酸內切酶，以根據原始的核苷三磷酸分子中是否存在所述修飾而產生(i)僅帶有第一熒光團的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件或(ii)僅帶有第二熒光團的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件或(iii)分別帶有第一和第二熒光團的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件的混合物；(3)從所述(b2)組分和所述對中的又一個第一寡核苷酸產生又一個使用的探針雙鏈體，然后迭代步驟(2)和(3)；(4)在步驟(2)或(3)中的任何一個或兩個之后，用具有3’-5’核酸外切活性的酶消化所述第一寡核苷酸元件，以產生可檢測狀態的熒光團，以及(5)檢測在步驟(4)中釋放的所述熒光團，并從觀察到的熒光信號的性質推斷所述原始的單核苷三磷酸分子是否被修飾。

2.檢測分析物中給定的核苷三磷酸分子的核堿基是否包括給定化學或結構修飾的方法，其特征在于以下步驟：(1)在聚合酶存在下，使所述分析物與包含以下組分的生物探針反應：(a)一對單鏈第一寡核苷酸，其各自包含核酸外切酶封閉位點；位于所述封閉位點的3’側的至少一個限制性核酸內切酶識別位點；位于所述識別位點內的單個核苷酸捕獲位點以及分別位于所述識別位點3’側的第一和第二熒光團，所述第一和第二熒光團被布置為基本上不可檢測的，和(b)至少一個第二和任選地至少一個第三單鏈寡核苷酸，其各自與所述第一寡核苷酸分開并且能夠與所述對中的一個、另一個或兩個第一寡核苷酸的捕獲位點的3’和5’側的互補側翼區域雜交，以產生由(b1)和(b2)組成的使用的探針雙鏈體，其中，(b1)是所述對中的一個或另一個第一寡核苷酸，(b2)是包含所述第二寡核苷酸、源自所述核苷三磷酸分子的一個或其他個修飾的或未修飾的核苷酸以及任選地所述第三寡核苷酸的組分，其中每個雙鏈體包含四個可能的(b1)/(b2)雙鏈體排列中的一個；(2)將步驟(1)中產生的所述雙鏈體與限制性核酸內切酶系統反應，所述限制性核酸內切酶系統包含至少一種適合于選擇性地在所述識別位點切割所述(b1)鏈的限制性核酸內切酶，以根據原始的核苷三磷酸分子中是否存在所述修飾而產生(i)僅帶有第一熒光團的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件或(ii)僅帶有第二熒光團的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件或(iii)分別帶有第一和第二熒光團的可核酸外切消化的第一寡核苷酸元件的混合物；(3)從所述(b2)組分和所述對中的又一個第一寡核苷酸產生又一個使用的探針雙鏈體，然后迭代步驟(2)和(3)；(4)在步驟(2)和(3)中的任何一個或兩個之后，用具有5’-3’核酸外切活性的酶消化所述第一寡核苷酸元件，以產生可檢測狀態的熒光團；以及(5)檢測在步驟(4)中釋放的所述熒光團，并從觀察到的熒光信號的性質推斷所述原始的單核苷三磷酸分子是否被修飾。

3.權利要求1或權利要求2所述的方法，其特征在于，所述限制性核酸內切酶系統包含(i)第一限制性核酸內切酶，其僅能夠切割包含帶有所述第一熒光團的第一寡核苷酸以及包含所述第二寡核苷酸、源自所述分析物的修飾的核苷三磷酸分子和所述第三寡核苷酸的組分的那些(b1)-(b2)雙鏈體；和(ii)第二限制性核酸內切酶，其僅能夠切割包含帶有所述第二熒光團的第一寡核苷酸核以及包含所述第二寡核苷酸、源自所述分析物的未修飾的核苷三磷酸分子和所述第三寡核苷酸的組分的那些(b1)-(b2)雙鏈體。