[發明專利]用于原位生殖系基因組工程的方法和組合物

在審

• 申請號: 201880068136.2
• 申請日: 2018-08-23
• 公開（公告）號: CN111655861A
• 公開（公告）日: 2020-09-11
• 發明（設計）人: 佐藤正彥;甘納巴薩瓦亞·古魯姆特希;大塚正人
• 申請（專利權）人: 內布拉斯加大學董事委員會;學校法人東海大學;佐藤正彥
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12N15/873;A01K67/027
• 代理公司: 中原信達知識產權代理有限責任公司 11219
• 代理人: 金海霞;劉慧

1.一種在生殖器官含有受精合子的對象中進行生殖系基因組工程的方法，所述方法包括：

(a)在所述對象授精后一定時間段后從所述對象分離或獲得所述生殖器官；

(b)將試劑組合物引入到所述生殖器官中，所述試劑組合物包含核酸酶系統和/或外源多核苷酸，以及

(c)對所述生殖器官進行電穿孔。

2.權利要求1的方法，其中所述時間段在0.5天(12小時)至1.4天(33.6小時)之間。

3.權利要求2的方法，其中所述時間段為約0.7天(16.8小時)。

4.前述權利要求中任一項的方法，其中所述核酸酶系統包含RNA可編程核酸酶多肽和向導RNA多核苷酸。

5.權利要求4的方法，其中所述RNA可編程核酸酶多肽包含Cas9多肽，并且所述向導RNA包含crRNA和tracrRNA。

6.權利要求4的方法，其中所述RNA可編程核酸酶多肽包含Cpf1多肽。

7.前述權利要求中任一項的方法，其中所述試劑組合物還包含單鏈(ssDNA)修復模板。

8.前述權利要求中任一項的方法，其中使用NEPA21電穿孔儀，使用下述參數對所述生殖器官進行電穿孔：穿孔脈沖：50V，5-ms脈沖，50-ms脈沖間隔時間，3次脈沖，10％衰減(±脈沖方向)，以及轉移脈沖：10V，50-ms脈沖，50-ms脈沖間隔時間，3次脈沖，40％衰減(±脈沖方向)。

9.前述權利要求中任一項的方法，其中使用CUY21EDIT II電穿孔儀，使用下述參數對所述生殖器官進行電穿孔：方波(mA)，(+/-)，Pd V：60V或80V，Pd A：150mA，Pd開：5.00ms，Pd關：50ms，Pd N：3，衰減：10％，衰減類型：對數。

10.前述權利要求中任一項的方法，其中所述對象通過使所述對象與另一個對象交配來授精。

11.前述權利要求中任一項的方法，其中所述對象是小鼠或大鼠。

12.前述權利要求中任一項的方法，其中所述生殖器官是輸卵管。

13.權利要求12的方法，其中通過將所述試劑組合物注射到所述輸卵管的腔中，將所述試劑組合物引入到所述輸卵管中。

14.一種在對象授精后一段時間后來自于所述對象的含有受精合子的生殖器官，所述生殖器官包含試劑組合物，并且所述試劑組合物包含核酸酶系統和/或外源多核苷酸。

15.權利要求14的生殖器官，其中所述時間段在0.5天(12小時)至1.4天(33.6小時)之間。

16.權利要求15的生殖器官，其中所述時間段為約0.7天(16.8小時)。

17.權利要求14-16中任一項的生殖器官，其中所述核酸酶系統包含RNA可編程核酸酶多肽和向導RNA多核苷酸。

18.權利要求17的生殖器官，其中所述RNA可編程核酸酶多肽包含Cas9多肽，并且所述向導RNA包含crRNA和tracrRNA。

19.權利要求17的生殖器官，其中所述RNA可編程核酸酶多肽包含Cpf1多肽。

20.權利要求14-19中任一項的生殖器官，其中所述試劑組合物還包含單鏈(ssDNA)修復模板。