[發明專利]一種靶向HPK1的gRNA和一種編輯HPK1基因的方法

有效

• 申請號: 201880060379.1
• 申請日: 2018-09-20
• 公開（公告）號: CN111263808B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發明（設計）人: 廖學斌;司靜文
• 申請（專利權）人: 北京森妙生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 北京領科知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11690
• 代理人: 張丹;徐丹丹

1.一種具有HPK-1基因的基因破壞(例如，基因敲除)和/或誘導或能夠誘導基因破壞的試劑的免疫細胞。

2.如權利要求1所述的免疫細胞，其中所述基因破壞包括HPK-1基因的缺失、突變和/或插入，從而導致HPK-1基因失活、活性降低和/或表達降低。

3.如權利要求1或2所述的免疫細胞，其中所述基因破壞包括HPK-1基因的至少一個外顯子(例如，第一或第二外顯子)的至少一部分缺失。

4.如權利要求1-3中任一項所述的免疫細胞，其中所述基因破壞包括在HPK-1基因(例如，在第一或第二外顯子)中產生雙鏈斷裂(DSB)，所述雙鏈斷裂通過影響HPK-1基因的插入和缺失(插入缺失標記)的非同源末端連接(NHEJ)修復。

5.如權利要求1-4中任一項所述的免疫細胞，其中所述試劑是一種抑制性核酸分子。

6.權利要求5所述的免疫細胞，其中所述抑制性核酸分子是RNA干擾劑或包括RNA干擾劑。

7.如權利要求5或6所述的免疫細胞，其中所述抑制性核酸分子是、包括或編碼小干擾RNA(siRNA)、微RNA適應性shRNA、短發夾RNA(shRNA)、發夾siRNA、前體微RNA(pre-miRNA)或微RNA(miRNA)。

8.如權利要求5-7中任一項所述的免疫細胞，其中所述抑制性核酸分子包括與所述HPK-1基因的核酸序列互補的序列。

9.如權利要求5所述的免疫細胞，其中所述抑制性核酸分子是、包括或編碼與所述HPK-1基因的核酸序列互補的反義寡核苷酸。

10.如權利要求1-4中任一項所述的免疫細胞，其中所述試劑是或包括一種或多種降低或能夠降低HPK-1在所述免疫細胞中表達的分子，或編碼所述一種或多種分子的多核苷酸。

11.如權利要求10所述的免疫細胞，其中所述一種或多種分子是或包括或編碼反義分子、siRNA、shRNA、miRNA、基因編輯核酸酶、鋅指核酸酶蛋白(ZFN)、TAL效應子核酸酶(TALEN)或CRISPR-Cas9組合，所述CRISPR-Cas9組合特異性結合、識別或雜交所述HPK-1基因。

12.如權利要求10或11所述的免疫細胞，其中所述試劑包括基因編輯核酸酶、鋅指核酸酶(ZFN)、成簇的規律間隔的短回文重復序列(CRISPR)/Cas9和/或TAL效應子核酸酶(TALEN)。

13.如權利要求10-12中任一項所述的免疫細胞，其中所述試劑包括(a)具有與所述HPK-1基因的靶結構域(例如，在第一或第二外顯子中)互補的靶向結構域的gRNA，或編碼所述gRNA的多核苷酸；(b)Cas9蛋白，或編碼所述Cas9蛋白的多核苷酸，或者(a)和(b)的組合。

14.如權利要求10-12中任一項所述的免疫細胞，其中所述試劑包括Cas9分子和gRNA的復合物，所述gRNA具有與所述HPK-1基因的靶結構域(例如，在第一或第二外顯子中)互補的靶向結構域。

15.如權利要求13-14中任一項所述的免疫細胞，其中所述gRNA具有靶向結構域，所述靶向結構域包括與靶序列完全互補的序列相同或差異不超過3個核苷酸的序列，所述靶序列選自SEQ ID NO：1和11-15。

16.如權利要求13-15中任一項所述的免疫細胞，其中所述Cas9是化膿鏈球菌Cas9，其可選地通過插入核定位序列(例如，在所述Cas9分子的C端和N端的一者或二者插入)進行修飾。