[發明專利]使用裂解酶、切向流過濾和多模式色譜法的用于疫苗生產的多糖純化

在審

• 申請號: 201880057635.1
• 申請日: 2018-06-29
• 公開（公告）號: CN111295450A
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: S.V.卡普雷;A.K.達塔
• 申請（專利權）人: 創賞有限公司
• 主分類號: C12P19/04
• 分類號: C12P19/04
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 羅文鋒;梅黎

公開了改進的、成本上有效的和縮短的肺炎鏈球菌、B族鏈球菌、流感嗜血桿菌、傷寒沙門菌（S.Typhoid）和腦膜炎奈瑟氏菌的莢膜多糖的純化方法。該方法包括酶處理、切向流過濾和多模式色譜法純化的混合物。對于革蘭氏陰性細菌，內毒素去除方法涉及endotrap HD樹脂。這種縮短的方法與常規方法相比，以簡單的步驟和更高的產率獲得了用于制備人疫苗的WHO/EP/BP所需的純度。該方法的步驟避免了使用有機溶劑（例如醇、酚）和超速離心，否則其執行是昂貴且耗時的，和/或對于商業用途是有健康危害的。所公開的這種方法也是簡單、有效率、無毒、易于放大且環境友好的。

相關申請的引用

本申請要求2017年7月5日提交的美國臨時申請號62/528,683的優先權，所述申請的全部內容通過引用并入本文。

背景

1. 發明領域

本發明涉及用于有效純化細菌多糖的方法和組合物。該方法是有效率的、成本上有效的和可規模化的，并且涉及去除雜質以制備包括綴合疫苗的疫苗。

2. 背景描述

純化的CPS (莢膜多糖)用于生產疫苗，特別是有效針對由細菌產生的感染的疫苗，CPS從所述細菌衍生。在常規方法中，在工業生物反應器中培養細菌，并將CPS純化至預定或所需的純度要求。用于疫苗生產的細菌CPS的傳統純化方法基于用溶劑（如乙醇和苯酚）以及陽離子去污劑的若干選擇性沉淀步驟。

流感嗜血桿菌(H. Influenzae)、腦膜炎奈瑟氏菌(N. meningitidis)、B族鏈球菌(Group B Streptococcus)和肺炎鏈球菌(S. pneumonia)是嬰兒和免疫缺陷成人中腦膜炎、肺炎和菌血癥的最常見的媒介物中的一些。莢膜多糖(CPS)充當針對宿主免疫系統的防御機制，這使得它們成為這些細菌毒力的主要因素。基于衍生自這些生物體的多糖的疫苗對成年人群有效。關于多糖疫苗的免疫原性特征有若干研究。純化方法的目的是獲得具有所需規格的產物，同時使產率最大化并使方法成本最小化。常規程序的最終純化步驟涉及一系列純化步驟，其中在生產效率和污染物的去除之間存在折衷。CPS純化中的污染物例如是蛋白質、核酸、色素和不希望有的多糖，例如革蘭氏陽性細菌的細胞壁多糖或革蘭氏陰性細菌的脂多糖(LPS)。

常規的CPS純化方法遵循通過乙醇和/或陰離子去污劑選擇性沉淀進行濃縮/純化、通過苯酚提取蛋白質以及對于革蘭氏陰性細菌通過超速離心以去除LPS的一般方法。

例如，對來自腦膜炎奈瑟氏菌的多糖的常規純化包括用陽離子去污劑cetavlon沉淀，在1M CaCl₂中將沉淀物重懸，用乙醇沉淀兩次，通過用苯酚的三個提取步驟脫蛋白，透析，以及進一步的乙醇沉淀。通過超速離心從CPS中分離LPS。

對肺炎鏈球菌CPS的常規的純化方法包括用去污劑脫氧膽酸鹽進行的總細胞裂解、濃縮/滲濾、四個步驟的乙醇沉淀、通過苯酚處理進行的脫蛋白和活性炭。

對流感嗜血桿菌PRP的常規的純化方法用通過苯酚、甲醛或硫柳汞對細胞進行的滅活和通過離心對培養肉湯進行的分離開始。然后用50-100kDa截斷膜通過切向流超濾濃縮澄清的上清液，用陽離子去污劑cetavlon沉淀，以及用氯化鈣使復合物PRP-cetavlon溶解，然后進行若干次乙醇沉淀，并通過用苯酚提取進行脫蛋白，以及進一步的乙醇沉淀。通過超速離心從PRP中分離脂多糖。