[發明專利]包含葡萄糖特異性、ATP介導的轉運蛋白的經修飾的酵母

在審

• 申請號: 201880055076.0
• 申請日: 2018-08-21
• 公開（公告）號: CN111065648A
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: D·J·馬庫爾;Y·J·王;P·J·M·特尼森;Q·Q·朱
• 申請（專利權）人: 丹尼斯科美國公司
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12P7/06
• 代理公司: 北京市中咨律師事務所 11247
• 代理人: 陳迎春;黃革生

描述了涉及表達外源或增加量的葡萄糖特異性、ATP介導的轉運蛋白的經修飾的酵母的組合物和方法。與親本細胞相比，經修飾的酵母生產增加量的乙醇。這種酵母對于從淀粉底物大規模生產乙醇特別有用。

技術領域

本發明的組合物和方法涉及具有葡萄糖特異性、ATP介導的轉運蛋白的經修飾的酵母。與在其他方面相同的酵母相比，經修飾的酵母在淀粉水解產物發酵中產生增加量的乙醇。這種酵母對于從淀粉底物大規模生產乙醇特別有用。

背景技術

第一代基于酵母的乙醇生產將糖轉化為燃料乙醇。全世界酵母的年度燃料乙醇產量為約900億升(Gombert,A.K.和van Maris.A.J.(2015)Curr.Opin.Biotechnol[生物技術現狀].33:81-86)。據估計，乙醇生產成本的約70％是原料。因為所述生產量如此之大，所以甚至小的產率提升對于該產業也將具有巨大的經濟影響。

生化方面，葡萄糖向乙醇和二氧化碳的轉化是氧化還原中性的，最大理論產率為約51％。然而，在酵母生長過程中，存在過剩的NADH，用于生產甘油以實現氧化還原平衡和滲透保護。目前，從玉米醪液中酵母發酵的用于乙醇生產的工業產率為約45％，因此，有機會將乙醇的產率再增加10％，這可以轉化為另外的九十億升乙醇。除不可避免的二氧化碳外，酵母生物質和甘油是該發酵過程的兩個主要副產物。

單糖和其他簡單糖是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的首選碳和能量來源(Leandro,M.J.,等人(2009)FEMS Yeast Res[歐洲微生物學會聯合會酵母研究].9:511-25)。許多單糖轉運蛋白通過促進擴散而起作用，以能量獨立的方式使此類分子沿細胞膜上的濃度梯度移動。其他單糖轉運蛋白是耗能的，允許糖分子以濃度梯度攝取，與質子的同時運動相結合。此類轉運蛋白通常僅在生長培養基中存在有限的糖時才起作用。釀酒酵母中己糖的攝取僅通過約二十種轉運蛋白(包括Hxt蛋白)介導的促進擴散而發生(Lagunas,R.(1993)FEMS Microbiol.Rev[歐洲微生物學會聯合會微生物學研究].10:229-42)，這些轉運蛋白具有不同的動力學特性和調節方式(Reifenberger,E.等人(1997)Eur.J.Biochem[歐洲生物化學雜志].245:324-33)。糖攝取對代謝通量有重要影響(Elbing,K.D.等人(2004)Eur.J.Biochem[歐洲生物化學雜志].271:4855-64)，影響細胞生長、分解代謝抑制、發酵和呼吸(Goffrini等人(2002)J.Bacteriol[細菌學雜志].184:427-32；Barnett,J.A.和Entian,K.D.(2005)Yeast[酵母]22:835-94)。

工程化酵母實現自由能守恒是提高乙醇產率的策略之一(Gombert和van Maris,同上)。酵母的生長需要ATP形式的能量。在假設增加的糖的級分轉化為乙醇而不是生物質和甘油的情況下，如果ATP的消耗可以增加，則可以提高糖的乙醇產率，因為必須將更多的糖轉化為乙醇和二氧化碳以提供相同量的ATP用于細胞維持。據報道，液泡堿性磷酸酶(Ph08)的過表達提高了乙醇的產率(Semkiv,M.V.等人(2014)BMC Biotechnol[BMC生物技術].14:42)。然而，引入此類非化學計量的ATP消耗(尤其是工業應用)面臨的挑戰在于，在積極影響與降低的細胞穩健性之間進行微調(Gombert和van Maris,同上)。

釀酒酵母菌株已用ATP介導的蔗糖轉運蛋白進行了工程化。在工程化的菌株中，質子擠出所需的ATP降低了蔗糖上的厭氧ATP產率，從而導致乙醇產率提高(Basso,T.O.等人(2011)Met.Eng[代謝工程化].13:694-703)。然而，在當前的乙醇生產工業中，在美國，蔗糖不是主要底物。

將自由能守恒的概念與增加的糖攝取聯系起來以增加乙醇產率的機會仍然存在。

發明內容