[發(fā)明專利]載體和方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880054942.4
• 申請日: 2018-06-25
• 公開（公告）號: CN111065739A
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: J.克盧貝
• 申請（專利權(quán)）人: 斯尼普技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/10;C12N15/113;A61K48/00;A61P31/04
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 甘霖;彭昶

1.用于引入宿主細(xì)胞的核酸載體，其中所述細(xì)胞包含被所述細(xì)胞中的阻遏物阻遏的CRISPR/Cas系統(tǒng)，所述載體包含

(a) 編碼能夠使所述細(xì)胞中的CRISPR/Cas系統(tǒng)去阻遏的去阻遏物的核苷酸序列，其中所述序列在所述細(xì)胞中可表達(dá)以產(chǎn)生所述去阻遏物；和

(b) 用于在所述細(xì)胞中產(chǎn)生一種或多種crRNA的CRISPR陣列；和/或在所述細(xì)胞中編碼各自的指導(dǎo)RNA (gRNA)的一種或多種核苷酸序列；其中每種cRNA或gRNA能夠在所述去阻遏物存在的情況下指導(dǎo)Cas以修飾所述宿主細(xì)胞基因組的各自的原間隔區(qū)序列或修飾由所述宿主包含的附加體的原間隔區(qū)序列。

2.權(quán)利要求1的載體，其中核苷酸序列(a)包含用于在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)所述序列的組成型啟動子或強(qiáng)啟動子。

3.權(quán)利要求1或2的載體，其中核苷酸序列或陣列(b)包含用于在所述宿主細(xì)胞中表達(dá)所述序列或陣列的組成型啟動子或強(qiáng)啟動子。

4.任一前述權(quán)利要求的載體，其中(a)和(b)由相同操縱子包含或在所述細(xì)胞中可操作的共同啟動子的控制下。

5.任一前述權(quán)利要求的載體，其中所述宿主細(xì)胞是野生型宿主細(xì)胞。

6.任一前述權(quán)利要求的載體，其中一種或多種Cas序列的轉(zhuǎn)錄被阻遏，任選地其中I型CRISPR/Cas系統(tǒng)的CasA、B、C、D和E中的一種或多種的轉(zhuǎn)錄被阻遏。

7.任一前述權(quán)利要求的載體，其中所述宿主細(xì)胞基因組的Cas修飾

(a) 殺死宿主細(xì)胞；

(b) 減少細(xì)胞或附加體的生長或增殖；

(c) 增加細(xì)胞或附加體的生長或增殖；

(d) 減少或防止包含所述原間隔區(qū)序列或與所述原間隔區(qū)序列相鄰的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄；或

(e) 增加包含所述原間隔區(qū)序列或與所述原間隔區(qū)序列相鄰的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄。

8.任一前述權(quán)利要求的載體，其中所述阻遏物是H-NS、StpA、LRP或CRP。

9.任一前述權(quán)利要求的載體，其中所述去阻遏物是突變型H-NS、StpA、LRP或CRP，其能夠分別在宿主細(xì)胞中與H-NS、StpA、LRP或CRP阻遏物形成復(fù)合物以防止或減少CRISPR/Cas系統(tǒng)的阻遏。

10.任一前述權(quán)利要求的載體，其中所述去阻遏物是LeuO或LysR或其功能等效物。

11.任一前述權(quán)利要求的載體，其中所述細(xì)胞是細(xì)菌或古細(xì)菌細(xì)胞。

12.任一前述權(quán)利要求的載體，其中所述載體包含可表達(dá)的htpG序列。

13.任一前述權(quán)利要求的載體，其中所述細(xì)胞含有包含Cascade和Cas3的CRISPR/Cas系統(tǒng)，其中所述Cascade在宿主細(xì)胞中被阻遏，其中所述載體包含

(i) 可表達(dá)的核苷酸序列，其編碼所述Cascade阻遏的去阻遏物；和

(ii) 編碼Cas3的可表達(dá)的核苷酸序列，其中所述Cas 3能夠在宿主細(xì)胞中與去阻遏的Cascade一起發(fā)揮功能；

其中所述核苷酸序列能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)。

14.權(quán)利要求13的載體，其中(i)和(ii)的核苷酸序列在細(xì)胞中可操作的一種或多種組成型啟動子的控制下。