[發(fā)明專利]甲基化DNA分離和/或檢測用色譜用填充劑

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201880054882.6
• 申請(qǐng)日: 2018-08-27
• 公開（公告）號(hào): CN111050903B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 與谷卓也;松田康平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 積水醫(yī)療株式會(huì)社
• 主分類號(hào): B01J20/285
• 分類號(hào): B01J20/285;B01D15/36;B01J41/04;B01J41/14;B01J41/20;B01J47/00;C12N15/00;C12Q1/6886;G01N30/02;G01N30/88
• 代理公司: 北京集佳知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 金世煜;李書慧

本發(fā)明提供一種能夠高精度地檢測甲基化DNA的色譜用填充劑。一種甲基化DNA分離和/或檢測用離子交換色譜用填充劑，含有在表面具有陽離子性官能團(tuán)的疏水性交聯(lián)共聚物粒子構(gòu)成的基材粒子，該疏水性交聯(lián)共聚物包含二乙烯基芳香族單體。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于甲基化DNA的分離和/或檢測的色譜用填充劑。

背景技術(shù)

DNA甲基化是最常見的與癌變相關(guān)的表觀遺傳變化之一。作為癌細(xì)胞中的特征性表觀遺傳異常，已知有CpG島的異常DNA甲基化。CpG島是介由磷酸二酯鍵(p)連接的胞嘧啶(C)－鳥嘌呤(G)的2堿基序列高頻出現(xiàn)的區(qū)域，大多存在于基因上游的啟動(dòng)子區(qū)域。CpG島的異常DNA甲基化通過抑癌基因的失活等而參與癌變。

作為甲基化DNA的解析方法，已經(jīng)確立了利用亞硫酸氫鹽(bisulfite)法的方法。將單鏈DNA用亞硫酸氫鹽處理時(shí)，胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，但甲基化的胞嘧啶仍然為胞嘧啶。因此，對(duì)經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后的DNA進(jìn)行PCR時(shí)，甲基化胞嘧啶直接擴(kuò)增為胞嘧啶，但非甲基化胞嘧啶由尿嘧啶置換為胸腺嘧啶而被擴(kuò)增，因此由于DNA的甲基化而使PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列產(chǎn)生差異。以往的甲基化DNA的解析方法中，一般利用電泳、測序來檢測該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物的序列的差異。然而，這些方法的缺點(diǎn)是電泳、測序耗費(fèi)工夫和時(shí)間。

在生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域中，作為能夠簡便且高精度地分離和檢測核酸、蛋白質(zhì)、多糖類等生物體高分子的方法，廣泛使用離子交換色譜。對(duì)核酸進(jìn)行離子交換色譜分離時(shí)，一般使用利用核酸分子中的磷酸的負(fù)電荷來分離核酸的陰離子交換色譜。作為在陰離子交換色譜的柱填充劑中使用的陽離子性官能團(tuán)，有二乙氨基乙基等弱陽離子性基團(tuán)、季銨基等強(qiáng)陽離子性基團(tuán)。此外，專利文獻(xiàn)1中公開了能夠通過使用具有強(qiáng)陽離子性基團(tuán)和弱陽離子性基團(tuán)這兩者作為官能團(tuán)的柱填充劑的離子交換色譜來檢測20mer的寡核苷間的一個(gè)堿基的差異。

專利文獻(xiàn)2中公開了如下方法：通過將樣品DNA用亞硫酸氫鹽處理后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行使用具有強(qiáng)陽離子性基團(tuán)和弱陽離子性基團(tuán)這兩者作為官能團(tuán)的柱填充劑的離子交換色譜，從而檢測樣品DNA的甲基化。這是與以往的使用電泳、測序的方法相比能夠?qū)崿F(xiàn)簡便且短時(shí)間內(nèi)的甲基化DNA的解析的優(yōu)異的方法。

現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)

專利文獻(xiàn)1：國際公開公報(bào)第2012/108516號(hào)

專利文獻(xiàn)2：國際公開公報(bào)第2014/136930號(hào)

發(fā)明內(nèi)容

使用專利文獻(xiàn)2這樣的離子交換色譜的甲基化DNA的檢測方法中，為了提高檢測精度，要求使色譜法中的甲基化DNA的峰與非甲基化DNA的峰的分離度更大。本發(fā)明提供一種能夠高精度地分離和/或檢測甲基化DNA的色譜用填充劑。

本發(fā)明提供以下方案。

〔1〕一種甲基化DNA分離和/或檢測用離子交換色譜用填充劑，含有在表面具有陽離子性官能團(tuán)的疏水性交聯(lián)共聚物粒子構(gòu)成的基材粒子，該疏水性交聯(lián)共聚物包含二乙烯基芳香族單體。

〔2〕根據(jù)〔1〕所述的離子交換色譜用填充劑，其中，上述二乙烯基芳香族單體選自二乙烯基苯、二乙烯基萘、二乙烯基蒽、二乙烯基甲苯、二乙烯基二甲苯和二乙烯基聯(lián)苯。

〔3〕根據(jù)〔1〕或〔2〕所述的離子交換色譜用填充劑，其中，上述疏水性交聯(lián)共聚物在總質(zhì)量中含有3～15質(zhì)量％的上述二乙烯基芳香族單體。

〔4〕根據(jù)〔1〕～〔3〕中任一項(xiàng)所述的離子交換色譜用填充劑，其中，上述疏水性交聯(lián)共聚物包含上述二乙烯基芳香族單體、具有2個(gè)以上乙烯基的非芳香族疏水性交聯(lián)性單體和具有反應(yīng)性官能團(tuán)的單體。

〔5〕根據(jù)〔4〕所述的離子交換色譜用填充劑，其中，上述反應(yīng)性官能團(tuán)為縮水甘油基或異氰酸酯基。