[發明專利]指導核酸的產生和用途

在審

• 申請號: 201880051065.5
• 申請日: 2018-06-07
• 公開（公告）號: CN111094565A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: S·B·古爾格欽;M·L·卡彭特;M·拉斯穆森;S·拉德哈基什南;A·K·埃爾默
• 申請（專利權）人: 阿克生物公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/11;C12N15/113;C12N15/63
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務所 11494
• 代理人: 封新琴

1.一種制備核酸的集合的方法，其包括：

a.獲得靶核酸，每個靶核酸包含核酸指導的核酸酶的PAM位點；

b.使第一引物與所述靶核酸的PAM位點雜交，其中所述第一引物包含(i)與所述PAM位點互補的MAP位點，(ii)與所述核酸指導的核酸酶的識別位點互補的互補識別位點，和(iii)與啟動子位點互補的互補啟動子位點；

c.使用所述靶核酸作為模板延伸所述第一引物，由此產生包含所述第一引物的序列和與所述靶核酸互補的序列的第一延伸產物；

d.使第二引物與所述第一延伸產物雜交；和

e.使用所述第一延伸產物作為模板延伸所述第二引物，由此產生包含所述PAM位點、所述識別位點和所述啟動子位點的第二延伸產物。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述第二引物包含(i)所述核酸指導的核酸酶的PAM位點和(ii)隨機序列。

3.根據權利要求2所述的方法，其中所述隨機序列的長度介于約6個與約8個堿基之間。

4.根據權利要求1所述的方法，其中所述第一引物進一步包含限制酶的限制酶位點。

5.根據權利要求1所述的方法，進一步包括：

f.使銜接子與所述第二延伸產物連接，其中所述銜接子包含限制酶的限制酶位點；和

g.用所述限制酶切割所述第二延伸產物，使得從所述識別位點切割所述PAM位點和所述限制位點。

6.根據權利要求4或權利要求5所述的方法，其中所述限制酶包含MmeI、FokI或MlyI。

7.根據權利要求1所述的方法，其進一步包括去除未結合的第一引物或未結合的第二引物。

8.根據權利要求1所述的方法，其中延伸所述第一引物或延伸所述第二引物是用標記的核苷酸進行的。

9.根據權利要求8所述的方法，其中所述標記的核苷酸包含生物素化的核苷酸。

10.根據權利要求1所述的方法，其中所述識別位點的長度為約20個核苷酸。

11.根據權利要求1所述的方法，其中所述識別位點的長度為約15至約25個核苷酸。

12.根據權利要求1所述的方法，其中所述核酸指導的核酸酶包含Cas系統蛋白。

13.根據權利要求1所述的方法，其中所述核酸指導的核酸酶包含Cas9系統蛋白。

14.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含基因組DNA或cDNA。

15.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含人DNA。

16.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含宿主DNA。

17.根據權利要求1所述的方法，其中所述靶核酸包含真核生物DNA。

18.根據權利要求1所述的方法，其中所述互補識別位點包含至少一個修飾的核酸鍵。

19.根據權利要求18所述的方法，其中所述修飾的核酸鍵選自鎖核酸(LNA)、橋連核酸(BNA)、肽核酸(PNA)、拉鏈核酸(ZNA)、乙二醇核酸(GNA)、蘇糖核酸(TNA)和硫代磷酸(PTO)。

20.根據權利要求1所述的方法，其進一步包括使用所述啟動子位點轉錄所述第二延伸產物。