[發明專利]用于制備人乳低聚糖的微生物

在審

• 申請號: 201880050358.1
• 申請日: 2018-08-01
• 公開（公告）號: CN111094325A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發明（設計）人: M·佩拉查;S·維姆霍夫;F·邁因哈特
• 申請（專利權）人: 奧利格科學生物技術有限公司
• 主分類號: C07K14/245
• 分類號: C07K14/245;C07K14/435;C12P19/18;C12N9/10;A23L33/00
• 代理公司: 北京潤平知識產權代理有限公司 11283
• 代理人: 劉依云;喬雪微

人乳低聚糖(HMO)可用作例如嬰兒營養品、醫療營養品、功能性食品和動物飼料中的功能性成分。仍然需要制備HMO的改進方法。本發明提供了用于改進HMO制備的經遺傳修飾的微生物和使用其制備HMO的方法。本發明的微生物可以具有一種或多種提高產量的修飾，包括誘導型裂解系統，其允許容易地提取細胞內和細胞外的HMO；乳糖通透酶突變體，其可以增加細胞內乳糖水平；或分子伴侶，其可以增加用于產生HMO的關鍵酶的細胞內利用度。

技術領域

本發明涉及制備人乳低聚糖(HMO)的遺傳修飾的微生物和使用所述微生物制備HMO的方法。本發明還涉及培養本發明的微生物的培養基，通過本發明的制備方法制備的純化HMO，以及所述培養基和所述HMO的用途。

背景技術

人乳低聚糖(HMO)是在人乳中發現的結構多樣的非綴合聚糖。迄今為止已經鑒定了超過200種HMO，它們都是由僅五種單糖結構單元，即D-半乳糖(Gal)、D-葡萄糖(Glc)、N-乙酰基-D-葡糖胺(GlcNAc)、L-巖藻糖(Fuc)和唾液酸衍生物N-乙酰基-神經氨酸，與乳糖部分偶聯而構建的(Petschacher和Nidetzky，J Biotechnol.2016,235:61-83)。還原端可以是乳糖或由兩種結構類型的幾個二糖單元延伸的乳糖，這兩種結構類型是乳-N-二糖(Gal-β1，3-GlcNAc，I型)或氨基乳糖苷(Gal-β1，4-GlcNAc，II型，LacNAc)。HMO的結構和分類可以在例如Petschacher和Nidetzky，2016(同上)的圖1和表1中找到。

在HMO中，2'-巖藻糖基乳糖(2-FL)最豐富，占所有HMO的約30％。另一種突出的HMO是3'-巖藻糖基乳糖(3-FL)。其他的HMO為乳-N-四糖、乳-N-新四糖和乳-N-巖藻戊糖I。除了中性HMO外，酸性HMO也存在于人乳中，如3'-唾液酸乳糖、6'-唾液酸乳糖和3-巖藻糖基-3'-唾液酸乳糖、雙唾液酸-乳-N-四糖。已知HMO能保護免受病原體如空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、腸致病性大腸桿菌和溶組織內阿米巴(Entamoebahistolytica)的侵害(Bode，Early Hum Dev.2015；91(11)：619-22)。2-FL被認為具有通過防止毒素和病原體的上皮水平粘附而防御傳染病的能力。它刺激某些雙歧桿菌和受體類似物的生長，這提供了對毒性和病原性攻擊的保護，這在嬰兒中是最普遍的。基于這些發現，HMO，尤其是2-FL和3-FL，作為功能成分用于從嬰兒營養物到醫療營養物到功能食品和動物飼料的產品中是特別令人感興趣的。

HMO可從人乳或牛奶中提取。然而，在兩種情況下，難以獲得大量的和/或達到令人滿意的純度。

HMO也可以是化學合成的，然而，該技術不是穩健的并且化學合成的HMO的成本高。

另一方面，在經遺傳修飾的微生物中制備HMO有希望提供低成本的穩定和安全的制備方法。US7,521,212描述了通過遺傳修飾的大腸桿菌由前體乳糖制備低聚糖的方法，涉及lacZ基因的失活。EP2675899、EP2877574、EP2440661和EP3191499進一步描述了在遺傳修飾的微生物中產生用于2-FL或3-FL的不同巖藻糖基轉移酶。Huang等人，2017描述了遺傳修飾的大腸桿菌(E.Coli)中2-FL或3-FL的生物合成及其多重模塊優化策略(Huang等人，MetaEng.2017；(41)：23-38)。EP2440661描述了大腸桿菌表達糖輸出分子以增加2-FL向培養基中的輸出。