[發明專利]包括冷凍和解凍過程的獲得百日咳桿菌來源的蛋白質的方法

在審

• 申請號: 201880048447.2
• 申請日: 2018-07-23
• 公開（公告）號: CN111194321A
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發明（設計）人: 安東浩;崔起燮;文在勛;全亨珍;樸鐘冠;金惠連;崔普渼
• 申請（專利權）人: 株式會社綠十字
• 主分類號: C07K14/235
• 分類號: C07K14/235;C07K1/16;C07K1/18;C07K1/20
• 代理公司: 北京市萬慧達律師事務所 11111
• 代理人: 段曉玲;謝敏楠

本發明涉及一種獲得百日咳桿菌來源的PRN蛋白的方法，該方法包括能夠有效提高PRN蛋白的提取水平的冷凍和解凍過程。在本發明中，發現當在用尿素處理之前將粒料冷凍，然后在低溫下緩慢融化時，與在其他條件下的實驗組相比，PRN蛋白的提取水平有效地增加。另外，即使當該方法應用于大規模生產時，也有效地提高了PRN提取水平。因此，包括冷凍和解凍過程的百日咳桿菌的預處理方法，可以有效地用于批量生產為百日咳疫苗所用的PRN。

技術領域

本發明涉及一種純化百日咳桿菌(Bordetella pertussis)來源的PRN蛋白的方法，其包括冷凍和解凍過程。

背景技術

百日咳是一種急性呼吸系統疾病，主要發生于嬰兒，其特征是咳嗽2周或更長時間。百日咳桿菌是一種革蘭氏陰性，好氧的短球桿菌，據報道可引起百日咳。百日咳桿菌以人類為唯一宿主，主要通過呼吸道感染。另外，百日咳桿菌生活在呼吸道粘膜上，并引起人體疾病。在1930年代，一種細胞百日咳疫苗被開發出來，該疫苗被證明對百日咳具有預防作用。此外，在1940年代，百日咳疫苗與破傷風和白喉滅活的四聯疫苗聯合使用。但是，全細胞百日咳疫苗(whole-cell pertussis vaccine)的不良反應(驚厥、紅腫、發燒等)也有所報道。因此，需要開發安全的百日咳疫苗。

1950年代，對百日咳桿菌的發病機理進行了研究，且百日咳毒素(PT)、絲狀血凝素(FHA)、百日咳桿菌粘附素(PRN)(pertactin)和菌毛(FIM)等成分作為抗原被報道。之后，正在進行涉及分離和純化這些蛋白質的脫細胞(acelluar)百日咳疫苗的開發。1980年代后，日本首次開發了純化的百日咳疫苗并進行了疫苗接種。

蛋白(例如PT、FHA和PRN)必須純化以制備脫細胞百日咳疫苗。傳統上，抗原是通過重復硫酸銨沉淀和密度梯度離心同時純化的。但是，這種方法的缺點是會產生很多雜質，并且難以控制純化過程。另一種方法是使用物理和化學方法的組合分別純化每種抗原。韓國公開專利公報第2015-0124973號公開了一種脫細胞百日咳疫苗組合物，其包含PT、FHA和2和3型FIM。

同時，在包含混合三種或四種組分的百日咳疫苗的生產方法中，存在的問題是，甚至一種組分的生產率降低也可能增加整個生產周期。

因此，正在尋求一種有效地大量生產PRN蛋白的方法，以有效地制備百日咳疫苗。

發明內容

技術問題

鑒于此，發明人在努力尋求能夠增加百日咳桿菌PRN蛋白的提取量的條件的同時，確定了一種情況，即含有百日咳桿菌的樣品在特定條件下進行冷凍(冷擊(cold-shock))和解凍步驟，百日咳桿菌PRN蛋白的提取量增加，從而完成了本發明。

因此，本發明的目的是提供一種獲得PRN蛋白的方法，該方法可以導致百日咳桿菌的PRN蛋白的提取量增加。

問題的解決方案

為了實現上述目的，本發明提供了一種獲得百日咳桿菌來源的PRN蛋白的方法，其包括以下步驟：1)冷凍含有百日咳桿菌的樣品；2)解凍所述冷凍樣品；3)破碎(disrupting)所述解凍的樣品；4)純化所述被破碎的樣品。

發明的有益效果

根據本發明的獲得百日咳桿菌的PRN蛋白的方法包括，冷凍包含百日咳桿菌的樣品并在冷藏溫度下解凍該樣品，從而使PRN蛋白的提取量最大化。與不進行這樣的預處理的提取方法相比，通過將在上述條件下進行了預處理的樣品進行純化，從而獲得了PRN蛋白的情況中，PRN蛋白的提取量顯著增加。另外，所述獲得PRN蛋白的方法也可以有效地用于為了生產百日咳疫苗而大量生產的PRN蛋白。

附圖簡述

圖1顯示了PRN純化過程的流程圖。

圖2顯示了粒料(pellet)制備，解凍以及用尿素處理過程的詳細流程圖。