[發(fā)明專利]在外周血中循環(huán)的上皮細(xì)胞的分離

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201880048443.4
• 申請(qǐng)日: 2018-05-24
• 公開（公告）號(hào): CN111213058A
• 公開（公告）日: 2020-05-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 佩德羅·約瑟·羅梅羅·帕拉西奧斯;胡安·約瑟·迪亞茲·莫雄;約瑟·安東尼奧·洛倫特·阿科斯塔;迭戈·德·米格爾·佩雷斯;瑪利亞·約瑟·塞拉諾·費(fèi)爾南德斯;貝爾納迪諾·阿爾卡扎·納瓦雷特
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 格拉納達(dá)大學(xué);安達(dá)盧西亞健康服務(wù)部
• 主分類號(hào): G01N33/53
• 分類號(hào): G01N33/53;G01N33/58;C12N5/071
• 代理公司: 北京聿宏知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11372
• 代理人: 吳大建;康志梅

1.一種用于識(shí)別個(gè)體在外周血中循環(huán)的非腫瘤上皮細(xì)胞的方法，包括以下步驟：根據(jù)循環(huán)上皮細(xì)胞用胞質(zhì)內(nèi)、核和/或表面標(biāo)記物培養(yǎng)外周血樣本，并且通過免疫細(xì)胞化學(xué)、分子和/或細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)來(lái)檢測(cè)和識(shí)別細(xì)胞。

2.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，還包括對(duì)個(gè)體的外周血樣本進(jìn)行梯度密度分離的優(yōu)先步驟。

3.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的方法，其中，在梯度密度分離之后，執(zhí)行包括收集中間相并用鹽水緩沖液清洗的步驟，在用標(biāo)記物培育樣品之前。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述上皮細(xì)胞是來(lái)自肺、肝、胰腺的細(xì)胞，以及來(lái)自胃腺和腸腺、肝、生殖器官、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或任何它們的組合的細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)標(biāo)記物選自細(xì)胞角蛋白、波形蛋白、SP1(表面活性劑A和B抗原)或它們的任何組合。

6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中，細(xì)胞核標(biāo)記物選自轉(zhuǎn)錄因子，優(yōu)選選自Snail、Slug、SOX₂或它們的任何組合。

7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中，表面標(biāo)記物選自N-鈣粘蛋白，EpCam，CD44v6，AXL，EGFR，EMA，MUCIN，CD133，Sca1或它們的任何組合。

8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，循環(huán)肺細(xì)胞的標(biāo)記物，選自：

·表面標(biāo)記物：CD44v6、Sca1；

·細(xì)胞質(zhì)標(biāo)記物：細(xì)胞角蛋白、SP1；

·細(xì)胞核標(biāo)記物：SOX₂；

·它們的任何組合。

9.一種分離在外周血中循環(huán)的上皮細(xì)胞的方法，包括以下步驟：根據(jù)如權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步的包括通過親和分離技術(shù)分離經(jīng)識(shí)別的細(xì)胞。

10.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的分離在外周血中循環(huán)的上皮細(xì)胞的方法，其中，所述親和分離技術(shù)選自使用物理特性的技術(shù)，使用生物學(xué)特性的技術(shù)，或兩者的組合。

11.根據(jù)權(quán)利要求9或10所述的分離在外周血中循環(huán)的上皮細(xì)胞的方法，其中，所述親和分離技術(shù)選自：磁性分離，親和層析法，與單克隆抗體結(jié)合或與單克隆抗體一起使用的細(xì)胞毒性劑，與固相支持物結(jié)合的抗體“平移”，或它們的任何組合。

12.根據(jù)權(quán)利要求9-11中任一項(xiàng)所述的分離在外周血中循環(huán)的上皮細(xì)胞的方法，其中，所述親和分離技術(shù)是通過包覆特異性抗體的磁性顆粒來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

13.根據(jù)權(quán)利要求所述的分離在外周血中循環(huán)的上皮細(xì)胞的方法，其中，所述包覆特異性抗體的磁性顆粒選自：

a)直徑在20nm至500nm之間的一組顆粒，

b)直徑在4000nm到6000nm之間，優(yōu)選5000nm的一組顆粒，或

c)上述兩組顆粒組成一組顆粒。

14.一種獲取用于診斷、預(yù)后和分類患有表現(xiàn)出組織破壞和上皮細(xì)胞釋放的疾病的個(gè)體的數(shù)據(jù)的方法，包括使用如權(quán)利要求1-13所述的任何一種方法的步驟，還包括量化分離細(xì)胞的數(shù)量的步驟。

15.根據(jù)前述權(quán)利要求所述的獲取用于診斷、預(yù)后和分類患有表現(xiàn)出組織破壞和上皮細(xì)胞釋放的疾病的個(gè)體的數(shù)據(jù)的方法，進(jìn)一步包括將識(shí)別出的細(xì)胞數(shù)量與參考樣品進(jìn)行比較。

16.一種對(duì)表現(xiàn)出組織破壞和上皮細(xì)胞釋放的疾病的個(gè)體進(jìn)行診斷、預(yù)后和分類的方法，包括如權(quán)利要求14或15所述的方法，進(jìn)一步包括當(dāng)在外周循環(huán)血中檢測(cè)到循環(huán)上皮細(xì)胞的存在時(shí)，將該個(gè)體劃分為具有患表現(xiàn)出組織破壞和上皮細(xì)胞釋放疾病風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)體。