[發(fā)明專利]具有微管蛋白羧肽酶活性的蛋白質(zhì)的純化方法及其基于肽的抑制劑在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201880047893.1 | 申請日： | 2018-07-18 |
| 公開（公告）號： | CN111051331A | 公開（公告）日： | 2020-04-21 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 克孜茲托夫·羅戈夫斯基;西姆·范德蘭 | 申請（專利權(quán)）人： | 法國國家科學(xué)研究中心;蒙彼利埃大學(xué) |
| 主分類號： | C07K7/06 | 分類號： | C07K7/06;C12N9/48;C12N9/00;C07K7/08 |
| 代理公司： | 中原信達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11219 | 代理人： | 金海霞;劉慧 |
| 地址： | 法國*** | 國省代碼： | 暫無信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 具有 微管 蛋白 羧肽酶 活性 蛋白質(zhì) 純化 方法 及其 基于 抑制劑 | ||
1.一種從生物提取物中純化具有微管蛋白羧肽酶活性的蛋白質(zhì)的方法，所述方法包括：
(a)將所述生物提取物在0℃和10℃之間、優(yōu)選在2℃和5℃之間、更優(yōu)選在2℃的溫度下離心；
(b)回收步驟(a)的上清液，并且通過添加GTP并將混合物在35℃和40℃之間、優(yōu)選在37℃+/-2℃的溫度下溫育、然后離心來進(jìn)行第一微管聚合循環(huán)；
(c)回收步驟(b)的沉淀物，重懸于冰冷的緩沖液中，在4℃+/-1℃下溫育，并且通過添加GTP并將混合物在37℃+/-2℃下溫育、然后離心來進(jìn)行第二微管聚合循環(huán)；
(d)回收步驟(c)的沉淀物，重懸于冰冷的緩沖液中，在4℃+/-1℃下溫育，并且通過添加GTP并將混合物在37℃+/-2℃下溫育、然后離心來進(jìn)行第三微管聚合循環(huán)；
(e)將步驟(d)的沉淀物重懸，將混合物進(jìn)行離子交換色譜，并回收通過流；
(f)用60％飽和硫酸銨溶液沉淀所述通過流的蛋白質(zhì)；
(g)將步驟(f)的沉淀級分進(jìn)行疏水色譜，并通過將硫酸銨濃度逐漸降低至零進(jìn)行洗脫，以回收具有微管蛋白羧肽酶活性的蛋白質(zhì)級分。
2.權(quán)利要求1的純化蛋白質(zhì)的方法，其中
-所述第一聚合循環(huán)包括
(i)添加GTP并將混合物在37℃+/-2℃下溫育30分鐘+/-10分鐘；
(ii)在37℃+/-2℃下以22,000g+/-1,000g離心45分鐘+/-10分鐘；
和/或
-所述第二聚合循環(huán)包括：
(i)將所述混合物在冰上溫育30分鐘+/-10分鐘；
(ii)以150,000g+/-10,000g離心30分鐘+/-10分鐘；
(iii)回收上清液并添加GTP；
(iv)將所述混合物在37℃+/-2℃下溫育30分鐘+/-10分鐘；
(v)在30℃和37℃之間的溫度下以50,000g+/-1,000g離心30分鐘+/-10分鐘；
和/或
-所述第三聚合循環(huán)包括：
(i)將所述混合物在冰上溫育30分鐘+/-10分鐘；
(ii)回收上清液并添加GTP；
(iii)將所述混合物在37℃+/-2℃下溫育30分鐘+/-10分鐘；
(iv)在30℃和37℃之間的溫度下以50,000g+/-1,000g離心30分鐘+/-10分鐘。
3.權(quán)利要求1或2的純化蛋白質(zhì)的方法，其還包括步驟(g)的蛋白質(zhì)級分的質(zhì)譜表征步驟和/或還包括選擇含有蛋白酶結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)的步驟。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的純化蛋白質(zhì)的方法，其中所述生物樣品選自真核生物提取物，優(yōu)選動物提取物，更優(yōu)選哺乳動物提取物，例如腦提取物、睪丸提取物和肺提取物。
5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)的純化蛋白質(zhì)的方法，其中所述具有微管蛋白羧肽酶活性的蛋白質(zhì)級分包含至少一種與選自SEQ ID N°1、SEQ ID N°2、SEQ ID N°3、SEQ ID N°4、SEQ IDN°5、SEQ ID N°6、SEQ ID N°7、SEQ ID N°8、SEQ ID N°9、SEQ ID N°10和SEQ ID N°11的氨基酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％氨基酸序列同一性的蛋白質(zhì)。
6.權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)的純化蛋白質(zhì)的方法，其中將具有微管蛋白羧肽酶活性的天然或重組蛋白質(zhì)級分進(jìn)一步與微管接觸，并測量分離的酪氨酸(Y)的水平，從而確認(rèn)所述蛋白質(zhì)級分的微管蛋白羧肽酶活性，其中所述微管優(yōu)選包含合成的微管和/或α-微管蛋白，并帶有標(biāo)記的C-末端Y。
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