[發(fā)明專利]粗糙型腸炎沙門氏菌的獲取及其用于禽流感疫苗的基因改造

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201880039313.4
• 申請日: 2018-06-12
• 公開（公告）號: CN111094546A
• 公開（公告）日: 2020-05-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 克里斯蒂娜·拉塔薩·奧斯塔
• 申請（專利權(quán)）人: 獸醫(yī)制藥股份公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/11
• 代理公司: 成都超凡明遠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51258
• 代理人: 王暉;劉明

1.腸炎沙門氏菌3934vac突變株，其中包含waaL基因的缺失。

2.腸炎沙門氏菌3934vac突變株的產(chǎn)生方法，其中包括：

·構(gòu)建一個整合載體，構(gòu)建時通過PCR分別擴增waaL基因兩側(cè)的兩個片段，一個520bp(寡核苷酸A和B)，另一個504bp(寡核苷酸C和D)，其中寡核苷酸A、B、C和D為序列SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6

·分別在pKOB載體中提純和克隆PCR產(chǎn)物以進行擴增，以獲得用于擴增的pKOB::DwaaLR1載體，然后酶促分解、提純并結(jié)合到pDESTINATION載體中。

·將在大腸桿菌中產(chǎn)生的載體pDEST::waaL進行轉(zhuǎn)化，并通過PCR、微量制備和分解進行驗證；一旦構(gòu)建完成，pDEST::waaL質(zhì)粒將在腸炎沙門氏菌3934vac和3934vac sb13::clyA-fiberFAdV菌株中進行電穿孔，在42℃下的生長及之后在28℃下的切除促使其整合。

·通過帶有結(jié)構(gòu)外部的寡核苷酸(waaL E和F)的PCR雙同源重組驗證waaL基因的缺失，其中寡核苷酸E和F為SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10。

3.腸炎沙門氏菌重組禽類疫苗，其中包含腸炎沙門氏菌3934vac經(jīng)過修改的突變株，waaL基因的缺失。

4.腸炎沙門氏菌3934vac突變株，其中包含AVA-I纖維基因的完整序列和waaL基因的缺失。

5.產(chǎn)生腸炎沙門氏菌3934vac突變株的方法，其中包括：

·擁有一個腸炎沙門氏菌3934菌株。

·通過同源重組的第一步插入選擇盒，其中除抗生素抗性基因外，該盒在其側(cè)翼區(qū)域還包含與前噬菌體ST64B互補的序列；在攜帶同源重組的第一步中選擇盒的線性DNA存在下進行細菌電穿孔。

·同源重組第一步后，在含有抗生素的LB培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)化菌落。

·通過帶有序列SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25寡核苷酸的PCR，確認腸炎沙門氏菌3934染色體中盒體的存在。

·通過同源重組的第二步插入ClyA-fiberFAdV-His表達盒，其中表達盒替換選擇盒，表達盒包含序列SEQ ID NO：21

·通過蛋白質(zhì)印跡和SDS-PAGE驗證序列SEQ ID NO：21的表達產(chǎn)物，選擇腸炎沙門氏菌3934vac sb13::clyA-fiberFAdV菌株。

6.根據(jù)聲明5的方法，其中同樣包括：

·構(gòu)建一個整合載體，其中兩個位于waaL基因兩側(cè)的片段，一個為520bp基因(分別為序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的寡核苷酸A和B)，另一個為504bp基因(別為序列SEQ IDNO：5和SEQ ID NO：6的寡核苷酸C和D)通過PCR擴增以構(gòu)建整合載體。

·分別在pKOB載體提純和克隆PCR產(chǎn)物進行擴增，以獲得載體pKOB::DwaaLR1進行擴增，然后酶促分解、提純并結(jié)合到pDESTINATION載體中。

·將在大腸桿菌中產(chǎn)生的載體pDEST::waaL進行轉(zhuǎn)化，并通過PCR、微量制備和分解進行驗證；一旦構(gòu)建完成，pDEST::waaL質(zhì)粒將在腸炎沙門氏菌3934vac和3934vac sb13::clyA-fiberFAdV菌株中進行電穿孔，在42℃下的生長及之后在28℃下的切除促使其整合。

·通過帶有結(jié)構(gòu)外部的寡核苷酸SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10的PCR驗證通過雙同源重組的waaL基因的缺失。

7.腸炎沙門氏菌的重組禽類疫苗，其中包含帶有AVA-I纖維基因序列和waaL基因缺失的腸炎沙門氏菌3934vac經(jīng)過修改的突變株。

8.腸炎沙門氏菌3934vac突變株，其中包含表達盒SEQ ID NO：21和通過序列SEQ IDNO：8的存在驗證的waaL的缺失。

9.腸炎沙門氏菌3934vac的突變株，其中包含序列SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：8。