[發明專利]用于產生人少突膠質細胞和研究體外髓鞘形成的個性化3D神經培養系統

有效

• 申請號: 201880035193.0
• 申請日: 2018-04-13
• 公開（公告）號: CN110709092B
• 公開（公告）日: 2023-08-29
• 發明（設計）人: 麗貝卡·馬頓;塞爾久·P·帕斯卡
• 申請（專利權）人: 小利蘭·斯坦福大學托管委員會
• 主分類號: A61K35/30
• 分類號: A61K35/30;A61K35/545;A61P25/00;C12N5/00
• 代理公司: 北京弘權知識產權代理有限公司 11363
• 代理人: 郭放;許偉群

1.一種用于產生人相互作用的髓鞘性少突膠質細胞、神經元和星形膠質細胞的3D培養物的方法，所述方法包括：

(i)通過在包含有效劑量的BMP抑制劑和TGFβ抑制劑的培養基中培養多能干細胞的完整集落或單細胞聚集體達2到10天的時段在多能干細胞懸浮培養物中誘導神經命運，以生成漂浮球狀體的群體；

(ii)通過在包含成纖維細胞生長因子2(FGF2)和表皮生長因子(EGF)的培養基中以懸浮培養物形式進行培養1到4周而使漂浮球狀體的群體分化為神經祖細胞的球狀體；

(iii)通過在缺乏FGF2和EGF并且包含有效劑量的PDGF-AA、IGF-1、HGF、BDNF、NT3、胰島素、cAMP、T3和生物素的神經培養基中培養而使神經祖細胞的球狀體分化為包括少突膠質細胞的人少突球狀體(hOS)；

(iv)將所述hOS球狀體在神經培養基中維持延長的時間段，以產生包括相互作用的髓鞘性少突膠質細胞、神經元和星形膠質細胞的3D培養物，其中，所述神經培養基缺乏生長因子但包括抗壞血酸、胰島素、cAMP、T3和生物素。

2.如權利要求1所述的方法，其中所述細胞包含至少一個與髓鞘障礙相關的等位基因。

3.如權利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述多能干細胞是誘導多能干細胞。

4.如權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述BMP抑制劑為多索嗎啡，以及所述TGFβ抑制劑為SB-431542。

5.如權利要求4所述的方法，其中(i)中的所述懸浮培養物不含飼養層。

6.如權利要求1所述的方法，其中，從培養的第二天開始，(i)中的所述培養基還包含有效劑量的wnt抑制劑。

7.如權利要求1所述的方法，其還包括用音猬因子途徑激動劑和視黃酸或用音猬因子途徑激動劑和Wnt抑制劑對步驟(i)中的球狀體進行培養。

8.如權利要求1所述的方法，其還包括通過流式細胞術、磁性免疫選擇或免疫淘選從少突球狀體中分離少突膠質細胞。

9.如權利要求8所述的方法，其中將分離的少突膠質細胞暴露于目的候選試劑或治療。

10.如權利要求9所述的方法，其中將所述少突膠質細胞與神經元或神經祖細胞組合。

11.一種用于確定候選試劑對人少突膠質細胞的影響的方法，所述方法包括：使所述候選試劑與根據權利要求7所述的方法分化自人誘導多能干細胞(hiPSC)的一種或一組所述3D培養物接觸，其中所述少突膠質細胞任選地包含至少一個編碼與神經疾病相關的突變的等位基因；以及確定所述試劑對形態、遺傳或功能參數的影響。

12.如權利要求11所述的方法，其中所述候選試劑是免疫效應細胞。

13.如權利要求11所述的方法，其中所述候選試劑是免疫調節劑。

14.如權利要求11所述的方法，其中一組少突膠質細胞包括至少兩種具有不同基因型的少突膠質細胞。

15.如權利要求14所述的方法，其中所述一組少突膠質細胞包含在不同環境條件下的少突膠質細胞。