[發明專利]用于檢測樣品中的細胞外囊泡的方法

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• 申請號: 201880031733.8
• 申請日: 2018-05-16
• 公開（公告）號: CN110869764A
• 公開（公告）日: 2020-03-06
• 發明（設計）人: C.扎菲烏;D.維爾博爾德;A.庫拉維克;O.班納赫
• 申請（專利權）人: 于利奇研究中心有限公司
• 主分類號: G01N33/50
• 分類號: G01N33/50
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 張華;梅黎

本發明涉及一種用于檢測樣品中的細胞外囊泡的方法，包括以下步驟：a)將樣品施加到基底上，b)添加適合于檢測的探針，所述探針通過特異性結合至細胞外囊泡上來標記它們，和c)通過測量探針的特異性信號檢測所述細胞外囊泡，其中步驟b)可以在步驟a)之前實施。公開了用于實施該基底的試劑盒。

本發明涉及用于檢測樣品中的細胞外囊泡的方法。

背景技術

細胞外囊泡（EV）是可以由幾乎每個細胞分泌并由大量細胞再攝取的膜顆粒。這些囊泡可以將信息從一個細胞傳遞到另一個細胞。細胞外囊泡被劃分為三類：外泌體，其具有小于100 nm的直徑，其來源于細胞內部中的內體。較大的微顆粒（100-1000 nm），其直接從細胞膜脫離。細胞外囊泡的第三類是在細胞凋亡期間產生的囊泡。該囊泡可由不同的因素產生，例如細胞外刺激、微生物感染和其它應激因素。細胞外囊泡由其中結合了膜蛋白的脂質雙層和內部中的溶液組成。

在細胞外囊泡的內部中可以存在例如蛋白質、DNA和/或RNA，其被稱為貨物。一些少量的蛋白質在所有細胞外囊泡中重新找到，并且獨立于細胞類型被分泌[1]。這些包括在細胞內部中發現的蛋白質，例如肌動蛋白和微管蛋白，但也包括膜蛋白，如四跨膜蛋白CD9、CD63和CD81以及I類組織相容性復合物(MHC I)[1, 2]。在完全確定的細胞類型中重新找到其它蛋白質、DNA-和/或RNA-片段[3]。

細胞外囊泡的生物學角色是復雜的并且還未完全搞清楚。目前已知，細胞外囊泡此外可以從細胞中排除不希望的蛋白質，但也可以在細胞-細胞通訊中發揮作用，例如在刺激免疫系統的情況下[1]。這些囊泡在一些危及生命的疾病如心血管疾病、腎疾病中和在許多癌癥中也起著重要作用，并且可以直接指示特定的疾病[3-6]。由于細胞外囊泡被細胞釋放到周圍的介質中并也經腎臟排泄，因此在體液如血液、腦脊液中以及在尿液中找到它們，它們在這些體液中被檢測到并且能夠提供有關疾病的信息而無需進行活檢[3, 7]。

另一個應用領域是使用由癌細胞分泌的細胞外囊泡。這些可以用作疫苗[8]。因此，一方面可以實現對危險患者的免疫接種，另一方面可以由此制備生物制藥活性物質，例如抗體，并且用于治療目的。也考慮直接使用外泌體用于治療目的[7]。

在細胞外囊泡的檢測和表征中的黃金標準是電子顯微鏡技術，其中低溫透射電子顯微術是最靈敏的技術。該方法提供了對細胞外囊泡的尺寸分布的最高分辨率和最準確的報告，并且也可以用免疫染色來表征細胞外囊泡。不利的是，樣品準備困難，測量極其費時并且該方法總體上非常昂貴。此外，其需要良好訓練的人員，因此其既不適合于絕對定量，也不適合于常規診斷[9]。

用于分析細胞外囊泡的最廣泛使用的方法是流式細胞術(FCM)，其由大都稀釋的樣品中借助于光學性質在流過檢測器時識別和計數各個囊泡和細胞。在其標準實施方案中，流式細胞術借助于折射率通過光散射進行分類和計數。雖然散射強度也能夠給出關于各個顆粒的尺寸的信息，但是檢測下限不利地為大約400 nm。在一個改進的版本中，另外用熒光標記過的抗體標記細胞外囊泡，并且除了光散射之外也評估熒光信號。優點在于，可以表征細胞外囊泡，并且尺寸分辨率極限降至約100 nm。在最新的流式細胞術中，用照相機記錄熒光信號，并且可以激發不同的波長，由此存在檢測不同類型的細胞外囊泡的可能性。然而，該技術的缺點在于，在流中始終只能將一個特性歸于某一特定的囊泡，從而只要沒有費力地除去介質中的殘余物，該方法也一起檢測來自介質的殘余物。此外，在圖像輔助的流式細胞術中，分辨率下限也為100 nm下[9]。

在與FCM結合的電阻脈沖方法(RPS)中，樣品溶液流過兩個電極之間的在其上施加電壓的孔。通過的顆粒增加電極之間的電阻，由此可以計數顆粒。這種方法可達到的檢測下限為40 nm并且取決于孔直徑。不利的是，該孔可能堵塞，并且可能難以找到最佳設置，以對具有非均勻尺寸分布的樣品中的所有顆粒進行計數。此外，用該方法不能表征細胞外囊泡[10]。

也可以使用動態光散射(DLS) 。雖然其可以簡單地操作并且具有直至5-10 nm的檢測下限，但是該方法不適用于定量細胞外囊泡。偽影也可能干擾[9]。