[發明專利]用于識別低密度脂蛋白的酸性狀態及糖化狀態的檢測試劑及試劑盒

在審

• 申請號: 201880027414.X
• 申請日: 2018-04-27
• 公開（公告）號: CN110799533A
• 公開（公告）日: 2020-02-14
• 發明（設計）人: 山田健一;井手友美;石田悠馬;一圓剛;山本啟一
• 申請（專利權）人: 扶桑藥品工業株式會社;山田健一
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C07D413/12;G01N21/78;G01N33/53
• 代理公司: 11363 北京弘權知識產權代理事務所(普通合伙)
• 代理人: 郭放;許偉群

本發明提供一種用于全面地檢測低密度脂蛋白的氧化狀態及糖化狀態的檢測試劑。更詳細的，根據本發明，在使用發色團標記抗體來檢測氧化低密度脂蛋白及糖化脂蛋白的同時，使用熒光氮氧自由基2,2,6?三甲基?4?(硝基苯并[1,2,5]噁二唑?7?基氨基)?6?戊基哌啶?1?氧基(NBD?Pen)來檢測脂質自由基。

技術領域

本發明涉及可視化地檢測氧化及糖化脂蛋白的技術。更具體地，本發明提供用于通過熒光觀察來檢測低密度脂蛋白中的脂質的氧化狀態及蛋白質的糖化狀態的檢測試劑及試劑盒。

背景技術

近年來，已經發現脂質的氧化、糖化會促進衰老。已知受到氧化、糖化等變質的脂質與各種疾病相關，通過查明這種脂質的變質(氧化及糖化)的產生原因，使其不僅在防止老化、美容領域，在疾病的預防及治療方面也發揮用處的研究越來越多。

超氧陰離子基團、羥基自由基、過氧化氫及單態氧等活性氧簇(ROS)影響生物體內的各種現象，其中，已知羥基自由基的反應性極強，會帶來各種疾病，正在積極地對其進行研究。已將發現這種羥基自由基作用于脂質而生成脂質自由基(lipid radical)。

由于脂質自由基反應性高且不穩定，因此生成脂質自由基時會連鎖地發生脂質過氧化反應，產生脂質過氧化物，進而生成作為代謝產物的親電性化合物。脂質含有許多不飽和脂肪酸，由于其活性亞甲基部分的氫原子被奪走，因此容易受到自由基的攻擊，誘發由反應式(a)～(c)示出的過程所構成的脂質過氧化連鎖反應(圖1)。

(式1)

LH+R·→L·+RH (a)

LOO·+LH→LOOH+L· (c)

自由基(R·)從不飽和脂肪酸(LH)奪走氫元素，開始連鎖反應(a)；利用所生成的脂質自由基(L·)與氧分子的反應，來生成脂質過氧自由基(Lipid peroxyl radical)(LOO·)(b)；而后，脂質過氧自由基從周圍的不飽和脂肪酸奪走氫原子，生成過氧化脂質(LOOH)和脂質自由基(L·)(c)。在再生的脂質自由基(L·)的作用下，開始下一次的連鎖反應循環。

關于過氧化脂質(LOOH)，可轉化為以丙二醛、4-羥基-2-壬烯醛、丙烯醛、丙醛、乙二醛為首的數百種以上的親電性化合物作為其代謝產物。

已經發現這些代謝產物單獨地、或者形成與蛋白質的復合體后，各自具有細胞毒性、炎癥、致突變性。

在生物體內，不溶于水的脂質與載脂蛋白結合而形成脂蛋白。此外，形成細胞膜所必須的膽固醇也不溶于水，同樣地與載脂蛋白結合。根據比重，脂蛋白被分類為高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等。

特別是LDL中的脂質(圖2a)在ROS等的作用下生成脂質自由基，并經由過氧化脂質而生成代謝產物。如此，將只有脂質受到氧化變質狀態的LDL(oxidized-state LDL)稱為輕度修飾LDL(minimally modified oxidized LDL；MM-LDL)(圖2b)。進而，生成的代謝產物通過LDL中的蛋白質的賴氨酸殘基、精氨酸殘基來進行結合，成為所謂的氧化修飾LDL(oxidized LDL；OxLDL)(圖2c)。

如圖3所示，通過大量的研究已將發現這種氧化修飾LDL會引起以年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration；AMD)、動脈硬化為首的各種疾病(例如，非專利文獻1、2等)。