[發(fā)明專利]將銜接子附接至樣品核酸的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201880025117.1
• 申請日: 2018-04-13
• 公開（公告）號: CN110546272A
• 公開（公告）日: 2019-12-06
• 發(fā)明（設計）人: 安德魯·肯尼迪;斯特凡尼·安·沃德·莫蒂默
• 申請（專利權(quán)）人: 夸登特健康公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 11262 北京安信方達知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司
• 代理人: 李敏春;鄭霞<國際申請>=PCT/US2

公開了制備具有單鏈突出端的雙鏈核酸以便擴增和測序的方法。使平端雙鏈核酸分子與Taq接觸導致單核苷酸向核酸的3'末端的非模板指導的添加，其中A被最頻繁地添加A，隨后是G，隨后是C和T。G加尾頻繁得足以使得核酸分子與銜接子的連接效率可以通過包括用T和C加尾的銜接子而顯著增加。用平端銜接子連接未成功進行加尾的平端核酸分子，連接效率可以甚至進一步增加。

交叉引用

本國際專利申請要求于2017年4月14日提交的美國臨時專利申請第62/485,769號、于2017年4月18日提交的美國臨時專利申請第62/486,663號和于2017年6月8日提交的美國臨時專利申請第62/517,145號的優(yōu)先權(quán)日的權(quán)益；并且還要求于2017年4月14日提交的國際專利申請PCT/US2017/027809的優(yōu)先權(quán)日的權(quán)益，每個專利申請為了所有目的通過引用以其整體并入。

序列表

本申請包括2018年4月10日創(chuàng)建的1千字節(jié)的txt文件512837-ST25內(nèi)的序列，其通過引用并入。

背景

癌癥是世界范圍疾病的主要原因。每年，全世界有數(shù)千萬人被診斷為患有癌癥，并且多于一半最終因其死亡。在許多國家，癌癥列為繼心血管疾病之后的第二大最常見死亡原因。對于許多癌癥，早期檢測與改善的結(jié)果相關。

癌癥通常通過對腫瘤進行活檢，隨后分析細胞、標志物或從細胞提取的DNA來檢測。但是最近已經(jīng)提出，癌癥也可以通過體液，諸如血液或尿液中的無細胞核酸來檢測(參見，例如，Siravegna等人，Nature Reviews2017)。這樣的測試具有的優(yōu)點是，它們是非侵入性的并且可以在不鑒定待活檢的可疑癌細胞的情況下進行。然而，體液中的核酸的量非常低。因此，這樣的分析需要有效的將體液中的天然無細胞DNA轉(zhuǎn)化為易于分析的形式的方法。

從患者的樣品中制備用于分析的DNA分子通常包括先修復單鏈突出端，以允許連接至銜接子以便擴增和測序。修復可以通過消化突出鏈或延伸相對鏈以產(chǎn)生平端，隨后使5'末端磷酸化并平端連接至銜接子來實現(xiàn)。可選擇地，在平端化之后，平端可以用Taq聚合酶進行A加尾。將A加尾的片段與在3'末端包含單核苷酸T尾的銜接子退火并連接。此構(gòu)型有利于期望的銜接子-DNA分子連接，但對于在其中僅有少量核酸可用的樣品，該樣品中的DNA分子向可被測序的分子的總體轉(zhuǎn)化效率可能仍然低得不可接受。

概述

本發(fā)明提供了制備用于分析的核酸的方法，所述方法包括：(a)通過提供5'-3'聚合酶活性和3'-5'校正活性的一種或更多種酶以及四種標準類型核苷酸的作用，使樣品中具有單鏈突出端的雙鏈核酸平端化，其中伴隨在5'末端的單鏈突出端用作通過聚合酶活性延伸互補鏈的模板，并且伴隨在3'末端的單鏈突出端被產(chǎn)生平端核酸的校正活性消化；(b)在不將平端核酸與樣品的其他組分分離的情況下，通過無3'-5'校正功能的聚合酶的作用對平端核酸進行末端加尾，該無3'-5'校正功能的聚合酶進行核苷酸向平端核酸的3'末端的非模板指導的添加，其中A優(yōu)先于G被添加，G優(yōu)先于C或T被添加；(c)使來自步驟(c)的核酸與在3'末端具有單核苷酸T或C突出端的至少部分雙鏈的銜接子退火，；以及(d)將核酸連接至銜接子。任選地，該方法還包括在步驟(a)之后將一種或更多種酶變性。任選地，該方法還包括使樣品與一種或更多種酶、四種標準類型核苷酸和無3'-5'校正功能的聚合酶接觸。任選地，樣品與一種或更多種酶、四種標準類型核苷酸和無3'-5'校正功能的聚合酶一起接觸。任選地，步驟(b)在比步驟(a)更高的溫度進行。任選地，步驟(a)在環(huán)境溫度進行，并且步驟(b)在超過60℃的溫度進行。任選地，一種或更多種酶是具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'校正活性的聚合酶。任選地，無3'-5'校正功能的聚合酶是熱穩(wěn)定聚合酶，并且該方法還包括在步驟(a)之后升高樣品的溫度，以使具有5'-3'聚合酶活性和3'-5'校正活性的聚合酶失活。任選地，該方法還包括(e)擴增連接至銜接子的核酸；和(f)分析該核酸。