[發明專利]通過檢測鎂離子診斷耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的試劑盒

在審

• 申請號: 201880021724.0
• 申請日: 2018-12-21
• 公開（公告）號: CN111868258A
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 樸秦佑;崔在虎;李奉奎;金炯洙;金基元;李在成;全孝成;尹素羅
• 申請（專利權）人: 佰愛特有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12Q1/04;G01N33/84;C09B29/28;C09B29/30;C09B29/16
• 代理公司: 上海段和段律師事務所 31334
• 代理人: 李慧;郭國中

本發明涉及用于確定樣品的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)感染的診斷試劑盒，使用診斷試劑盒確定MRSA感染的方法是通過肉眼觀察LAMP反應后的顯色變化來進行，所述顯色變化是由鎂濃度的變化引起的，可利用與鎂離子敏感地反應的本發明中開發的特定染料化合物來確認。在本發明中，使用環介導的等溫擴增(LAMP)進行所述MRSA DNA的擴增，使得本發明提供的診斷試劑盒具有隨時隨地方便使用和快速診斷的優點。

技術領域

本發明涉及一種試劑盒，在判斷樣品是否感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌時，能夠利用染料化合物通過肉眼確認在環介導的等溫擴增(Loop-mediated isothermalamplification,LAMP)中產生的二價鎂離子(Mg²⁺)濃度的變化，以此簡單地確定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的感染與否。

背景技術

最近，在生物診斷領域，一種能夠在沒有昂貴設備的情況下進行快速現場測試的診斷系統即當場即時檢測(Point of care Test,POCT)市場正在迅速發展，并且現有基因測試和分子診斷試劑盒開發出很多適用于新平臺的內容，以具有這種市場競爭力。

目前主要使用的診斷方法包括細菌培養鑒定方法、PCR和堿基序列分析方法，以及直接測量細菌的POCT。然而，根據檢測，有些以診斷實驗室為中心需要高級設備和大量人力。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA：Methicillin-resistant Staphylococcusaureus)是主要引起傷口感染、肺炎和敗血癥等醫院獲得性感染的細菌。MRSA主要由mecA基因產生青霉素結合蛋白的改變(altered penicillin binding protein,PBP 2a,PBP 2’),因此對青霉素(penicillin)、頭孢菌素(cephalosporin)和碳青霉烯(carbapenem)等所有β-內酰胺類(β-lactam)抗生素具有耐藥性,甚至對其他類型的抗生素如大環內酯(macrolide)、克林霉素(clindamycin)、四環素(tetracycline)和氨基糖苷類抗生素(aminoglycoside)具有抗性，是多種耐藥性細菌，為了選擇合適的抗菌藥物和管理醫院獲得性感染，需要準確、快速的細菌鑒定和抗生素敏感試驗。

MRSA的準確鑒定包括使用DNA探針(DNA probe)或聚合酶鏈反應(PCR：polymerasechain reaction)直接檢測mecA基因的分子生物學測試方法和使用免疫印跡法(immunoblotting)或免疫放射分析法(IRMA：immunoradiometric assay)檢測mecA基因的產物即PBP 2a的方法等，但是諸如特殊設備、昂貴的試劑、復雜的測試記錄和測試時間等條件使其不適合在普通實驗室常規使用，而傳統抗生素敏感檢測法因為孵育時間單獨需要24小時并且根據培養基的類型和培養條件顯示抗性表達的差異，因此很難期望快速和準確的結果。

在使用直接測量這些細菌的POCT方法的情況下，存在的問題是高成本和測試結果的靈敏度和準確性未達到可靠水平。最近，為了克服該問題，已經提出了一種適用于使用環介導的等溫擴增(LAMP：Loop-mediated isothermal amplification)進行病原體檢測的技術。

現有技術中的聚合酶鏈反應(PCR)需要三個溫度變化：變性(denaturation)、退火(annealing)和延伸(extension)。然而，在環介導的等溫擴增(LAMP)中，由于DNA擴增反應在一個溫度下發生，因此不像聚合酶鏈反應那樣需要單獨的特殊機器(PCR機器)。

在環介導的等溫擴增(LAMP)中，由于靶核酸可在60至65℃下在1小時內擴增至109拷貝，因此可僅使用約64至65℃的恒溫保持裝置就可以進行測量，測試時間短至30至60分鐘，可肉眼進行觀察，并且不需要購買昂貴設備和掌握操作設備所需的專業知識，因此可簡單且容易地擴增DNA。