[發(fā)明專利]環(huán)狀DNA的復(fù)制或擴(kuò)增方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201880018564.4
• 申請日: 2018-02-28
• 公開（公告）號: CN110446783A
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 末次正幸;奈良圣亞
• 申請（專利權(quán)）人: 奧利希羅基因組學(xué)有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進(jìn)委員會專利商標(biāo)事務(wù)所 11038
• 代理人: 何楊

1.一種無細(xì)胞系統(tǒng)中的環(huán)狀DNA的復(fù)制方法，其包含以下的工序：

工序(1)：形成成為模板的環(huán)狀DNA與反應(yīng)液的反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)液包含以下組分：

催化環(huán)狀DNA的復(fù)制的第一酶組、

催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成環(huán)連體的2個姊妹環(huán)狀DNA的第二酶組、和

催化2個姊妹環(huán)狀DNA的分離反應(yīng)的第三酶組；和

工序(2)：使工序(1)中形成的反應(yīng)混合物進(jìn)行反應(yīng)；

其中，該環(huán)狀DNA包含能夠與具有DnaA活性的酶結(jié)合的復(fù)制起始序列(origin ofchromosome(oriC))、并且還包含分別相對于oriC向外插入的1對ter序列和/或被DNA多聚體分離酶識別的堿基序列，

其中，在該環(huán)狀DNA具有ter序列的情況下，所述工序(1)的反應(yīng)液還包含具有結(jié)合于ter序列而抑制復(fù)制的活性的蛋白質(zhì)，并且，在該環(huán)狀DNA具有DNA多聚體分離酶識別的堿基序列的情況下，所述工序(1)的反應(yīng)液還包含DNA多聚體分離酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，DNA多聚體分離酶為Cre或XerCD。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，就分別相對于oriC向外插入的1對ter序列而言，作為一方的ter序列在oriC的5’側(cè)插入有包含序列號1～14所示的序列中的任一序列的序列、作為另一方的ter序列在oriC的3’側(cè)插入有包含序列號1～14所示的序列的互補(bǔ)序列的序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項所述的方法，其中，具有結(jié)合于ter序列而抑制復(fù)制的活性的蛋白質(zhì)為Tus蛋白或RTP蛋白。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，XerCD識別的堿基序列為包含序列號15～24所示的序列中的任一序列的序列或其互補(bǔ)序列。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，Cre識別的堿基序列為包含序列號30～35所示的序列中的任一序列的序列或其互補(bǔ)序列。

7.一種核酸，為具有273bp～2.0kb的長度的線狀DNA，包含oriC、以及分別相對于oriC向外插入的1對ter序列和/或DNA多聚體分離酶識別的堿基序列。

8.一種無細(xì)胞系統(tǒng)中的環(huán)狀DNA的復(fù)制方法，其包含以下的工序：

工序(1)：將oriC轉(zhuǎn)座子和轉(zhuǎn)座酶添加到緩沖液中而形成oriC轉(zhuǎn)座體，其中，oriC轉(zhuǎn)座子為包含能夠與具有DnaA活性的酶結(jié)合的復(fù)制起始序列(origin of chromosome(oriC))的線狀DNA且其兩末端包含外端(OE)序列；和

使oriC轉(zhuǎn)座體和不含oriC的環(huán)狀DNA在緩沖液中進(jìn)行反應(yīng)，進(jìn)行轉(zhuǎn)移反應(yīng)；

由此制備包含oriC的環(huán)狀DNA；

工序(2)：形成(1)中得到的包含oriC的環(huán)狀DNA與反應(yīng)液的反應(yīng)混合物，所述反應(yīng)液包含以下組分：

催化環(huán)狀DNA的復(fù)制的第一酶組、

催化岡崎片段連接反應(yīng)而合成形成環(huán)連體的2個姊妹環(huán)狀DNA的第二酶組、和

催化2個姊妹環(huán)狀DNA的分離反應(yīng)的第三酶組；和

工序(3)：使工序(2)中形成的反應(yīng)混合物進(jìn)行反應(yīng)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，OE序列包含序列號25(5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’)所示的序列及其互補(bǔ)序列，在工序(1)的線狀DNA的5’末端插入有包含序列號25所示的序列的OE序列，在該線狀DNA的3’末端插入有包含序列號25所示的序列的互補(bǔ)序列的OE序列。