[發明專利]細胞的凍存組合物和凍存方法

在審

• 申請號: 201880009336.0
• 申請日: 2018-01-30
• 公開（公告）號: CN110234750A
• 公開（公告）日: 2019-09-13
• 發明（設計）人: 野上明日香;龍見宗樹;石井七瀨;竜瑞之;平田善彥;澤芳樹;宮川繁;齋藤充弘;大河原弘達
• 申請（專利權）人: 莎羅雅株式會社;國立大學法人大阪大學
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;C12N5/071
• 代理公司: 北京康信知識產權代理有限責任公司 11240
• 代理人: 田喜慶

凍存細胞時，簡便地進行添加來提高細胞的存活率。一種組合物，含有0.01重量％到20重量％的槐糖脂，從即將凍存細胞到凍存細胞6小時前的期間，添加該組合物并使該組合物達到1容量％后保存細胞。該組合物會減少細胞遭受的凍害，由此可提高凍存時的細胞存活率，從而能夠在不使用DMSO和血清的情況下保存細胞。并且，凍存細胞時也不需要對凍結速率進行精細的控制，是一種簡便低廉的保存方法。

技術領域

本發明涉及一種用于凍存細胞的凍存組合物和使用了該凍存組合物的凍存方法。

背景技術

在防止傳代導致的細胞轉化、防止隨傳代產生的雜菌造成汚染、輸送細胞等方面，細胞凍存是一種必需技術，其已得到廣泛利用。但是，已知：在凍結細胞的過程中細胞內外的水分會形成冰結晶而對細胞造成損害(非專利文獻1)。因此，期望：保護細胞在凍結、融化時不受損害，而且在維持細胞性質的狀態下進行凍存。

就普通的凍存而言，為了保護細胞不受由冰結晶引發的損害，一般采用下述做法：使細胞懸浮于添加有抗凍劑的含有牛血清等的培養液中，然后裝入Cryo Tube(低溫保存管)凍存管等中進行冷卻，最終在－80℃或－196℃的極低溫度下進行凍存?？箖鰟┎捎?～20％的二甲基亞砜(DMSO)、甘油(Gly)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)等(專利文獻1、2)。其中效果最高、最常用的是DMSO(非專利文獻2)，但其并不能使細胞的保存率達到令人滿意的結果，對冰結晶的抑制效果也不一定稱得上充分。

此外，有通過添加聚醚來增強DMSO的效果的方式(專利文獻3)、通過使用果聚糖(Fructan)來提高細胞保護效果的方式(專利文獻4)、通過配合羧化多聚賴氨酸開提高干細胞的保存效果的方式(專利文獻5)，但冰結晶生成抑制效果都稱不上充分。而且，聚醚的殘留帶來的細胞毒性令人擔憂，需要有一種毒性更低的保存液。此外，果聚糖由于添加濃度高達30％而存在經濟方面的問題、保存后難以除去的問題，羧化多聚賴氨酸的細胞保存僅著眼于干細胞，因此通用性差，且由于是多肽，對細胞的功能性的影響令人擔憂，等等，出于上述原因，上述做法對細胞的保存效果并不一定令人滿意。因此，需要一種能夠保存任何細胞的低毒性的保存液。

專利文獻1：日本專利第5940975號

專利文獻2：日本公開專利公報特開2001－247401號

專利文獻3：日本公開專利公報特表平10－511402號

專利文獻4：日本公開專利公報特開2012－235728號

專利文獻5：日本專利第5630979號

專利文獻6：日本公開專利公報特開2016－160244號

非專利文獻1：Mazur，Am.J.Physiol.，247：C125－142，1984

非專利文獻2：Kovelock JE and Bioshop MWH，Nature 183：1394－1395，1959

發明內容

－發明要解決的技術問題－

就現有的凍存法而言，對冰結晶的生成抑制效果不充分，保護細胞不受凍害影響的效果不充分，因此需要開發一種毒性較低的新型凍存劑。

－用以解決技術問題的技術方案－

本發明的發明人為解決上述問題而進行了潛心研究。其結果是，發現了：槐糖脂(SL)具有抑制冰結晶生成的效果，能夠簡便地抑制凍害對細胞的損害。利用這一點，發現了：通過向凍存前的細胞培養液中添加0.01重量％到20重量％的SL，能提高細胞的保存效率。還發現了：凍結細胞時，若添加0.01重量％到20重量％的SL，則能緩和DMSO的毒性。而且發現了：通過向0.01重量％到20重量％的SL中添加1重量％到50重量％的多元醇，能在不添加DMSO的情況下提高保存后的細胞存活率。即，本發明提供以下技術方案。