[實用新型]一種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的膠體金免疫層析速測卡

有效

• 申請號: 201820793751.7
• 申請日: 2018-05-25
• 公開（公告）號: CN208224281U
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 李鵬;唐雪明;潘愛虎;賈軍偉;武國干;白藍;王金斌
• 申請（專利權）人: 上海市農業科學院
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/573
• 代理公司: 上海開祺知識產權代理有限公司 31114
• 代理人: 張曉敏;費開逵

一種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的膠體金免疫層析速測卡，其包括，膠板、粘著在膠板上依次相連的樣品墊、金標結合墊、反應膜和吸水墊；所述金標結合墊中固定有由CpTI蛋白制備的多克隆抗體?膠體金復合物；在所述反應膜一端包被有能與抗原CpTI結合的特異抗體，作為檢測線，所述特異抗體為由CpTI蛋白制備的多克隆抗體；在反應膜的另一端包被二抗抗體羊抗兔IgG，作為質控線。本實用新型結構簡單，能有效避免出現交叉反應和污染，特異性強，靈敏度高，且，操作簡便，檢測過程無需專門儀器和熟練技能，適用于轉基因產品中CpTI的現場快速檢測以及安全性評價。

技術領域

本實用新型屬于豇豆胰蛋白酶抑制劑的檢測領域，具體涉及一種檢測豇豆胰蛋白酶抑制劑的膠體金免疫層析速測卡。

背景技術

豇豆胰蛋白酶抑制劑(Cowpea Trypsin Inhibitor，CpTI)屬絲氨酸蛋白酶抑制劑。

昆蟲攝入蛋白酶抑制劑后，與昆蟲腸道的蛋白酶形成穩定的復合物，從而使昆蟲的蛋白消化酶活性受到抑制；同時，蛋白酶和蛋白酶抑制劑的復合物還可能作為一個負反饋信號抑制昆蟲的進食。上述雙重效應將降低害蟲對食物蛋白的有效利用率，同時，也減少了食物的攝取，最終導致昆蟲由于缺乏必需的營養(蛋白質)停止發育，擾亂了昆蟲的正常代謝，最終導致昆蟲發育遲緩甚至死亡。

Hilder(1987)首先報道了將CpTI基因導入煙草，獲得了對煙草夜蛾有顯著抗性的轉基因植株。在國內，劉春明(1993)首先分離克隆了CpTI基因，并獲得了轉基因煙草、水稻、棉花。隨后，郝貴霞(1999)、張七仙(2001)、郭三堆(1999)等獲得了轉CpTI基因毛白楊、甘藍、煙草、玉米、小麥、甜椒、花椰菜。

目前，對于轉基因植物中豇豆胰蛋白酶抑制劑，基于免疫學原理建立的特異性檢測方法有3種：酶聯免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)、側向流動型免疫試紙條方法(Lateral Flow strips)和Western雜交檢測法。

ELISA法直接檢測外源基因蛋白，可定量檢測，所需樣品少，操作標準，檢測靈敏，可對大量樣品檢測。但是，ELISA檢測方法的適用范圍有限，需要專業的技術人員和復雜的儀器設備，耗時比較長，還需從樣品中完全提取殺蟲蛋白，適合于實驗室環境下的檢測工作，不適合用于田間篩查和現場檢測。

Western雜交檢測法是利用抗體與抗原在硝酸纖維素膜上特異性結合的原理，對外源蛋白進行檢測。該方法首先通過PAGE電泳，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，再進行印跡免疫，最后通過標記的二抗進行檢測。Western檢測的靈敏度很高，檢測限一般為納克級別。但是，Western檢測步驟比較繁瑣，需要進行蛋白提取，PAGE電泳和免疫反應等過程，技術和設備要求高，不適用于常規大量樣品的檢測。

膠體金免疫層析檢測法(Immune colloidal gold technique)，也是基于抗原抗體的特異性結合的三明治夾心式技術原理，標記的抗原-抗體復合物側向移動，直至與固定在表面上的另一種抗體結合顯色，與ELISA法不同之處是，以硝酸纖維素膜代替聚苯乙烯反應板為固相載體。在整個檢測設備中只包括所需的試劑，沒有儀器的要求，整個操作過程相對簡單。與核酸和ELISA檢測方法相比，該方法對樣品的處理比較簡單。待檢目的蛋白一般是對抗體高度特異的水溶性蛋白，因此，樣品不需要復雜的純化操作，就能進行檢測。

膠體金免疫層析檢測方法是一種快速、簡便的定性檢測方法，將試紙條放在待測樣品抽提物中，5-10min就可得出結果，檢測過程無需專門儀器和熟練技能，經濟便捷，特別適用于田間和現場樣品的檢測。

目前，將現有的免疫膠體金技術應用到檢測轉基因產品的外源蛋白中，仍然存在許多問題，例如，特異性差，靈敏度不高，成本高，因此，亟需對現有免疫膠體金技術進行改進，研制特異性強，靈敏度高、穩定性好、重復性好的檢測轉基因產品外源蛋白的新方法。