[發明專利]一種高效高通量篩選納米抗體的方法有效
| 申請號： | 201811651966.6 | 申請日： | 2018-12-31 |
| 公開（公告）號： | CN110117603B | 公開（公告）日： | 2023-01-13 |
| 發明（設計）人： | 伍椰南;周輝;潘藝;王楊 | 申請（專利權）人： | 湖南省腫瘤醫院 |
| 主分類號： | C12N15/63 | 分類號： | C12N15/63;C12P21/02;C07K16/00 |
| 代理公司： | 長沙睿翔專利代理事務所(普通合伙) 43237 | 代理人： | 周松華;孫建霞 |
| 地址： | 410013 湖南*** | 國省代碼： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 高效 通量 篩選 納米 抗體 方法 | ||
1.一種高通量篩選特異性納米抗體的方法，其特征在于包括：
（1）構建納米抗體庫體外表達的載體結構，基因型-表型連接為硒代半胱氨酸特異性延伸因子SELB-SECIS 環，具體為：在T7啟動子后克隆SECIS 環, 之后克隆連接核糖體結合位點，核糖體結合位點后克隆連接SELB，之后克隆連接納米抗體庫；
（2）進行一輪淘選，通過無細胞表達體系體外表達納米抗體庫，用DNA酶消化剩余的載體DNA，將表達的納米抗體庫與特異性抗原互相孵育；
所述的淘選具體步驟為：
Ⅰ包被抗原：稀釋抗原后，包被于免疫PCR 試管中，孵育2h后清空試管，清洗；
Ⅱ 封閉：添加封閉液于室溫下封閉兩小時；
Ⅲ DNA 酶處理：將無細胞表達體系體外表達的蛋白產物與DNA酶Master Mix按1：10的比例混勻，以消除載體質粒帶來的污染干擾；
Ⅳ 納米抗體孵育：清空試管，用洗液清洗，在步驟Ⅰ包被的抗原之上，孵育抗體；
Ⅴ洗脫：清空試管，洗液清洗；
Ⅵ cDNA合成：以獲得淘選后富集得到的特異性抗體模板；
Ⅶ 定量qPCR驗證；
（3）進行多輪淘選洗掉非特異性納米抗體，富集特異性抗體；
（4）用測序的手段鑒定特異性納米抗體的序列。
2.根據權利要求1所述的一種高通量篩選特異性納米抗體的方法，其特征在于：將納米抗體庫表達序列克隆進納米抗體庫體外表達的載體結構，質粒在無細胞表達混合物中的終濃度為30ng/μL，在 37℃條件下震蕩 1小時,然后在30℃孵育2h，納米抗體庫體得到表達。
3.根據權利要求1所述的一種高通量篩選特異性納米抗體的方法，其特征在于所述的無細胞表達體系體外表達納米抗體庫是體外用Promega S30 High-Yield ProteinExpression System試劑盒，表達含有SELB-SECIS 環結構的納米抗體庫。
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