[發明專利]一種用于二代測序技術的快速高效低成本的文庫構建方法在審
| 申請號： | 201811645852.0 | 申請日： | 2018-12-29 |
| 公開（公告）號： | CN109609598A | 公開（公告）日： | 2019-04-12 |
| 發明（設計）人： | 孫廣欣;王冬;王建偉;伍啟熹;劉倩;劉珂弟;唐宇 | 申請（專利權）人： | 北京優迅醫學檢驗實驗室有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6806 | 分類號： | C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06 |
| 代理公司： | 北京路浩知識產權代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君;陳征 |
| 地址： | 100195 北京市海淀區*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 高效低成本 文庫構建 建庫 二代測序技術 生物信息學領域 反應時間縮短 高通量測序 緩沖液條件 磁珠純化 功能步驟 接頭連接 領域應用 末端修復 功能酶 堿基 | ||
1.一種用于二代測序技術的快速高效低成本的文庫構建方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)提取血漿中cfDNA，對其進行末端修復、5’末端磷酸化，3’末端加“A”堿基和接頭連接整合在一個反應容器中進行；
(2)接頭產物純化回收，獲得測序文庫。
2.根據權利要求1所述的構建方法，其特征在于，步驟(1)所述一個反應容器中包括先后兩個反應步驟，反應步驟I為末端修復、5’末端磷酸化，3’末端加“A”堿基同時進行獲得修飾后的cfDNA；反應步驟II為將反應步驟I的產物與接頭連接反應。
3.根據權利要求2所述的構建方法，其特征在于，步驟(1)中，反應步驟I的25μL的反應體系為：10×的反應I緩沖液2.5μL，反應I酶1μL，DNA 21.5μL。
4.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于，所述反應I緩沖液的溶劑是純水；％為質量體積比g/100mL，配方為：
5.根據權利要求3-4任一所述的構建方法，其特征在于，所述反應I酶的配方為：
T4 DNA聚合酶0.1-0.5u/μL，
T4多聚核酸激酶0.1-1u/μL，
Klenow片段0.1-0.3u/μL，
Klenow exo-3’→5’0.1-0.3u/μL，
rTaq DNA聚合酶0.1-0.5u/μL。
6.根據權利要求2-5任一所述的構建方法，其特征在于反應步驟I的反應條件為：30℃-37℃10min，優選37℃；65℃-75℃10min，優選72℃。
7.根據權利要求2-6任一所述的構建方法，其特征在于，步驟(1)中的反應步驟II的60μL的反應體系為：將2×應II緩沖液30μL，接頭3μL，反應步驟I的產物25μL混勻后瞬時離心，低溫下加入600U/μL的T4 DNA連接酶2μL混勻即得。
8.根據權利要求7所述的構建方法，其特征在于，所述反應II緩沖液的溶劑為水，配方為：Tris-HCl 10-70mM，MgCl21-10mM，DTT 1-5mM，ATP1-5mM，PEG6000-8000 5％-10％，所述為％質量g與體積100mL之比。
9.根據權利要求8所述的構建方法，其特征在于，反應步驟II的反應條件為：10℃-20℃，15min，優選20℃；65℃-75℃10min，優選65℃。
10.權利要求1-9任一所述的構建方法得到的文庫。
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