[發明專利]一種低起始量PCR-free高通量測序文庫的構建方法

在審

• 申請號: 201811644479.7
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109609597A
• 公開（公告）日: 2019-04-12
• 發明（設計）人: 孫廣欣;王冬;王建偉;伍啟熹;劉倩;劉珂弟;唐宇
• 申請（專利權）人: 北京優迅醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發明涉及生物信息學領域，具體提供了一種低起始量PCR?free高通量測序文庫的構建方法，包括以下步驟：(1)提取血漿中cfDNA，對其進行末端修復和5’末端磷酸化，末端修復產物用磁珠純化回收；(2)對純化后的末端修復產物，3’末端加“A”堿基和接頭連接體系整合在一個體系中進行反應；(3)接頭產物用磁珠純化，獲得測序文庫。該構建方法的優點在于成本低、耗時短，文庫構建無需PCR擴增，保持穩定的數據產出，對起始DNA的量要求不高，僅1?2ng的cfDNA用量就能夠滿足建庫需要，用于有效的測序，在實現高通量測序、無創診斷等研究中具有非常廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及生物信息學領域，具體地說，涉及一種適用于高通量測序的多樣品混合測序文庫的構建方法。

背景技術

隨著科學技術的進步發展，傳統毛細管電泳Sanger測序已不能完全滿足科學研究、臨床應用需求；基因組測序需要通量更高、效率更快、費用更低的技術平臺。高通量測序(NGS，也稱第二代測序)技術應運而生。高通量測序技術的核心思想是邊合成邊測序(SBS，sequencing by synthesis)，即每次合成一輪堿基后即刻進行識別，然后再合成下一輪堿基。現有的技術平臺主要包括illumina/Hiseq、NextSeq、Hiseq X ten、NovaSeq和LifeTechnologies system、PGM、Proton等。通量最高以NovaSeq 6000 System為代表，每個run兩天可以產出6TB數據，達到60個人基因組30X覆蓋的測序通量；測序通量和效率較HiseqXten都有2～3倍的提升；隨著高通量測序技術的成熟以及臨床研究、應用的發展，測序需求會進一步提升。從消費級體檢到臨床輔助診斷，對測序技術亦會帶來新的挑戰。

血漿DNA又稱循環cfDNA，是血液中的細胞外游離DNA，長約幾十到幾百核苷酸，既可以DNA-蛋白質復合物的形式存在，也可以是游離的DNA片段。正常情況下，血漿DNA來源于少量凋亡細胞的DNA釋放。健康狀態下，cfDNA的生成與清除處于動態平衡狀態，維持在較恒定的低水平。cfDNA能反映人體內細胞新陳代謝的狀況，是健康評判的一個重要指標，cfDNA含量和構成的改變與多種疾病(包括腫瘤、創傷、器官移植、妊娠相關疾病、感染性疾病、器官衰竭等)關系密切。

自從母體血液中的胚胎DNA被發現之后，無創診斷和檢測胚胎染色體整倍性異常成為臨床應用研究的熱點。2008年，盧熠明教授及團隊率先使用高通量測序技術檢測孕婦血漿DNA，統計染色體比例關系，血漿中微量胚胎DNA染色體數據目的變化能被檢測統計出來。隨著檢測技術的發展，世界許多國家均將此項技術納入醫學診斷的前沿來發展，并取得重大成果。部分國家或城市已將此項檢查納入居民醫療保障體系，我國在這一領域已居于世界前沿行列。

測序技術的發展，使測序能力和測序效率得到飛速提升；臨床應用的推廣，又帶動了的測序需求產生，對測序前樣本文庫制備效率提出了更高的要求。因此，文庫制備效率和成本將成為高通量測序面向應用的關鍵因素之一。

高通量DNA樣本的制備，目的是將待測的DNA兩端連接上與測序平臺相匹配的接頭序列，即將待測DNA裝到一個測序載體中。目前文庫構建步驟主要包括核酸提取(DNA提取)、末端修復及5’末端磷酸化、3’末端加“A”堿基、連接接頭、PCR擴增以及步驟間的純化操作。這種建庫方法操作復雜，成本較高，且需要的DNA起始量較高。此外，引入PCR過程容易造成樣本間的氣溶膠污染同時，因擴增酶性能差異，也會引入一定的堿基偏好，造成數據在基因組上的覆蓋度不均勻，導致測序結果的不準確。