[發(fā)明專利]同步檢測鑒定禽類、魚類、反芻類三大類成分的多重液相基因芯片的核酸和方法及試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811644290.8
• 申請日: 2018-12-30
• 公開（公告）號: CN109609662B
• 公開（公告）日: 2022-02-15
• 發(fā)明（設計）人: 陳茹;高小博;梅明珠;段燕喻;劉志玲;翁文川;陽靜
• 申請（專利權）人: 廣州海關技術中心
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6837;C12N15/11
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 楊永莉

1.一組用于同步檢測禽類、魚類、反芻類三大類成分的多重液相基因芯片的引物及探針，其特征在于，由禽類、魚類、反芻類中各類別的通用上游引物、通用下游引物和通用探針組成，其中，所述禽類的通用上游引物序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，其通用下游引物序列如SEQ ID No.3所示，通用探針如SEQ ID No.4所示；

所述魚類的通用上游引物序列如SEQ ID No.5所示，其通用下游引物序列如SEQ IDNo.6所示，通用探針如SEQ ID No.7；

所述反芻類的通用上游引物序列如SEQ ID No.8所示，其通用下游引物序列如SEQ IDNo.9所示，通用探針如SEQ ID No.10所示；其中，SEQ ID No.10中的R表示簡并堿基，代表G或A；

所有下游引物的5’端標記生物素，所有探針的5’端C12標記氨基。

2.一種用于同步檢測禽類、魚類、反芻類三大類物種成分的多重液相基因芯片的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如權利要求1所述的禽類、魚類、反芻類的各類別通用上游引物、通用下游引物和通用探針。

3.如權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括2×PCR緩沖液和DNA聚合酶，其中，所述2×PCR緩沖液中包括：濃度為40mmol/L、pH8.0的Tris-HCl，8mmol/L的MgCl₂，400μmol/L的dNTP，300mmol/L的KCl，1mg/mL的BSA和體積濃度為6％的甘油。

4.一種用于同步檢測禽類、魚類、反芻類三大類物種成分的多重液相基因芯片的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

S1、提取待檢樣品中的核酸；

S2、利用如權利要求1所述的用于檢測鑒定禽類、魚類、反芻類三大類成分的液相基因芯片的通用上游引物、通用下游引物對上述步驟S1提取的待檢樣品中的核酸進行不對稱PCR擴增，獲得PCR擴增產(chǎn)物；

S3、利用分別偶聯(lián)有如上所述禽類、魚類、反芻類的通用探針的聚苯乙烯乳膠微球，與步驟S2獲得的擴增產(chǎn)物進行雜交反應；

S4、用液相芯片儀檢測步驟S3雜交反應后的信號值即MFI值，根據(jù)檢測的本底值，判定檢測結果；

其中，所述本底值的設定：同步平行設定3個空白對照進行上述步驟S2、步驟S3的反應，其中在所述空白對照，用水取代待測樣品模板，其余試劑成分與反應條件不變；計算3個空白對照的測得的MFI值的平均值，作為本底值；

結果判定：當被檢樣品的MFI值大于5倍本底值時，判為陽性，否則判為陰性。

5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟S2中，所述PCR擴增的擴增體系，包括禽類、魚類、反芻類的各類別通用上游引物、通用下游引物、PCR緩沖液、DNA聚合酶、待檢樣品模板和水；其中，禽類的通用上游引物SEQ ID No.1終濃度為20nmol/L，SEQ ID No.2的終濃度為50nmol/L，禽類的通用下游引物的終濃度為120nmol/L；魚類的通用上游引物的終濃度為50nmol/L，其通用下游引物終濃度為120nmol/L；反芻類的通用上游引物終濃度為50nmol/L，其通用下游引物終濃度為120nmol/L。

6.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟S2中，所述PCR擴增的擴增反應條件為：95℃預變性2分鐘；95℃變性5秒，58℃退火8秒，72℃延伸2秒，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸1分鐘；4℃停留。

7.如權利要求4所述的方法，其特征在于，步驟S3中，所述雜交反應包括：

S301、將禽類、魚類、反芻類的通用探針偶聯(lián)到聚苯乙烯乳膠微球，所述聚苯乙烯乳膠微球帶有COOH；

S302、將步驟S2獲得的擴增產(chǎn)物與上述步驟S301中偶聯(lián)聚苯乙烯乳膠微球的探針進行雜交反應；

S303、雜交反應后，進行洗滌，之后加入鏈親和素藻紅蛋白進行溫育，

S304、取步驟S303獲得的溶液進行檢測MFI值。