[發(fā)明專利]一種基于環(huán)境DNA檢測(cè)草魚產(chǎn)卵場(chǎng)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201811640960.9
• 申請(qǐng)日: 2018-12-29
• 公開（公告）號(hào): CN109486915A
• 公開（公告）日: 2019-03-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉明典;宋江騰;汪登強(qiáng);段辛斌;劉紹平;陳大慶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

本發(fā)明公開了一種基于環(huán)境DNA檢測(cè)草魚產(chǎn)卵場(chǎng)方法，步驟是：(1)根據(jù)草魚繁殖習(xí)性，在每年的4?7月份草魚繁殖季節(jié)，篩選草魚產(chǎn)卵場(chǎng)位置范圍，在每個(gè)采樣點(diǎn)的長(zhǎng)江橫截面設(shè)置采樣位置，分別為左、左中、中間、右中、右，在每個(gè)采樣位置采樣時(shí)，分別取長(zhǎng)江表層、中層和下層水三次，采樣時(shí)須同時(shí)進(jìn)行采樣；(2)將采回的長(zhǎng)江水樣進(jìn)行抽濾，并將抽濾后的濾膜進(jìn)行DNA提取；(3)將濾膜DNA提取結(jié)果進(jìn)行熒光定量PCR分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)熒光定量PCR得出的CT值，比較每個(gè)采樣地點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推算草魚DNA濃度最高的采樣地點(diǎn)為產(chǎn)卵場(chǎng)的位置。該方法易行，操作簡(jiǎn)便，可以快速、準(zhǔn)確的找到長(zhǎng)江草魚的產(chǎn)卵場(chǎng)地，具有較大的應(yīng)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，更具體涉及一種基于環(huán)境DNA檢測(cè)草魚產(chǎn)卵場(chǎng)方法。

背景技術(shù)

草魚是鯉形目鯉科雅羅魚亞科草魚屬的唯一種，又名白鯇，草根魚，厚魚，與青魚，鳙魚，鰱魚并稱中國(guó)四大淡水魚。體略呈圓筒形，頭部稍平扁，尾部側(cè)扁；口呈弧形，無(wú)須；上頜略長(zhǎng)于下頜；下咽齒2行，側(cè)扁，呈梳形，齒側(cè)具橫溝紋；鱗中等大小；體呈淺茶黃色，背部青灰，腹部灰白，胸、腹鰭略帶灰黃，其他各鰭淺灰色。為中國(guó)東部廣西至黑龍江等平原地區(qū)的特有魚類。草魚背部的顏色為黑褐色、鱗片邊緣為深褐色，胸、腹鰭為灰黃色，側(cè)線平直，肉白嫩，骨刺少，適合切花刀作菊花魚等造型菜。草魚棲息于平原地區(qū)的江河湖泊，一般喜居于水的中下層和近岸多水草區(qū)域。性活潑，游泳迅速，常成群覓食，通常在被水淹沒的淺灘草地和泛水區(qū)域以及干支流附屬水體攝食肥育。為典型的草食性魚類。草魚以草為食，故北方飼養(yǎng)草魚也較多。在干流或湖泊的深水處越冬。生殖季節(jié)親魚有溯游習(xí)性，在激流江段產(chǎn)卵。產(chǎn)卵期在3～7月。卵漂流性。受精卵的卵膜吸水膨脹，順?biāo)鳌?齡性成熟。懷卵量為30萬(wàn)～138萬(wàn)粒。草魚已移殖到亞、歐、美、非各洲的許多國(guó)家。因其生長(zhǎng)迅速，肉味佳，飼料來(lái)源廣，是中國(guó)淡水養(yǎng)殖的四大家魚。

環(huán)境DNA(eDNA)的環(huán)境樣品是一個(gè)非常寬松的概念，可以包括土壤、沉積物、排泄物、空氣、水體，甚至生物個(gè)體本身(如馬氏網(wǎng)捕獲的昆蟲)。動(dòng)物在某個(gè)環(huán)境中生活，身上的各種痕跡會(huì)攜帶者自身DNA掉落到四周。作為一項(xiàng)技術(shù)，分析eDNA的目的就是獲取這些環(huán)境樣品中DNA所屬物種的分類學(xué)信息和基因功能信息。再講通俗一點(diǎn)，科學(xué)家提取環(huán)境樣品中的eDNA，就是為了分析這些DNA分別是屬于哪些物種，從而證實(shí)在相應(yīng)環(huán)境中存在哪些物種。eDNA的目的，與傳統(tǒng)的動(dòng)植物分類調(diào)查其實(shí)是一致的。

由于近年來(lái)長(zhǎng)江污染較重以及人類活動(dòng)的加劇，草魚產(chǎn)卵場(chǎng)和棲息地遭到破壞，野生的草魚數(shù)量直線下降。所以對(duì)草魚的產(chǎn)卵場(chǎng)進(jìn)行找尋并進(jìn)行保護(hù)是十分必要的。然而傳統(tǒng)的找尋草魚產(chǎn)卵場(chǎng)的方法需要大量的人力、物力和財(cái)力，包括對(duì)草魚卵苗的捕撈和對(duì)食卵魚的捕撈進(jìn)行解剖。目前利用環(huán)境DNA的方法對(duì)長(zhǎng)江草魚產(chǎn)卵場(chǎng)的找尋未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供了一種基于環(huán)境DNA檢測(cè)草魚產(chǎn)卵場(chǎng)方法，該方法易行，操作簡(jiǎn)便，可以快速、準(zhǔn)確的找到長(zhǎng)江草魚的產(chǎn)卵場(chǎng)地。

為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種基于環(huán)境DNA檢測(cè)草魚產(chǎn)卵場(chǎng)方法，其包括以下步驟：

(1)根據(jù)草魚繁殖習(xí)性，在每年的4-7月份草魚繁殖的季節(jié)，篩選草魚產(chǎn)卵場(chǎng)位置范圍，每2.5－3.5公里設(shè)置1－3個(gè)采樣點(diǎn)，在每個(gè)采樣點(diǎn)的長(zhǎng)江橫截面設(shè)置4－6個(gè)采樣位置，分別為左、左中、中間、右中、右。在每個(gè)采樣位置采樣時(shí)，分別取長(zhǎng)江表層、中層和下層(沒有具體要求，因?yàn)椴蒴~的受精卵隨機(jī)分布在長(zhǎng)江的水中，可深可淺)水三次。采樣時(shí)須同時(shí)進(jìn)行采樣。每一個(gè)采樣點(diǎn)須連續(xù)多次(3－8次)采樣。

(2)將采回的長(zhǎng)江水樣進(jìn)行抽濾，并將抽濾后的濾膜進(jìn)行DNA提取。

(3)將濾膜DNA提取結(jié)果進(jìn)行熒光定量PCR分析，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)熒光定量PCR得出的CT值，比較每個(gè)采樣地點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推算草魚DNA濃度最高(濃度越高說(shuō)明草魚活動(dòng)更為活躍)的采樣地點(diǎn)即為產(chǎn)卵場(chǎng)的位置。