[發(fā)明專利]一種用于提取保存的動物樣品中基因組DNA的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201811636752.1
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109593755A
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孟岳峰;孫晴晴;潘曉西;王建偉;伍啟熹;劉倩;劉珂弟;唐宇
• 申請（專利權(quán)）人: 北京優(yōu)迅醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

1.一種用于提取保存的動物樣品中基因組DNA的方法，其特征在于，包括在經(jīng)裂解處理的樣品中加入修復(fù)液進(jìn)行突變堿基消除和DNA損傷修復(fù)的步驟；所述修復(fù)液包含UNG酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)樣品裂解：在樣品中加入裂解液進(jìn)行裂解處理，分離得到核酸分離液；

(2)突變堿基消除和DNA損傷修復(fù)：在所述核酸分離液中加入所述修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)；所述UNG酶在反應(yīng)體系中的終濃度為10～50U/μL；

(3)分離和純化基因組DNA。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述突變堿基消除和DNA損傷修復(fù)為在45～55℃孵育處理1～2h。

4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述裂解液包含裂解緩沖液和蛋白酶K；

優(yōu)選地，所述蛋白酶K在反應(yīng)體系中的終濃度為15～50mg/mL；所述裂解緩沖液包括如下組分：十二烷基硫酸鈉1％～10％，異硫氰酸胍2～5mol/L，Tris-HCl 10～50mmol/L、EDTA0.01～0.2mol/L、Triton-X100 0.01％～0.1％；

所述裂解緩沖液的pH為7.5～8.0。

5.根據(jù)權(quán)利要求2～4任一項所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述樣品為石蠟包埋樣品時，所述裂解液還包括脫蠟液。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述脫蠟液包括正十六烷。

7.根據(jù)權(quán)利要求2～6任一項所述的方法，其特征在于，所述樣品裂解包括如下步驟：

(1)加入裂解液，振蕩混合，于50～65℃孵育1h～16h；

(2)90～95℃孵育40min～50min；

(3)分離收集含有核酸的水相溶液。

8.根據(jù)權(quán)利要求2～7任一項所述的方法，其特征在于，所述分離和純化基因組DNA包括如下步驟：

(1)在含有核酸的水相溶液中加入RNA酶去除RNA；

(2)采用核酸提取純化柱、磁珠分離或異丙醇沉淀分離基因組DNA；

(3)分離的基因組DNA經(jīng)洗滌和溶解，即得。

9.根據(jù)權(quán)利要求1～8任一項所述的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)在樣品中加入裂解液，振蕩混合，于55～60℃孵育1～4h；分離得到核酸分離液；

當(dāng)所述樣品為石蠟包埋樣品時，所述裂解液包括正十六烷、蛋白酶K和裂解緩沖液；

當(dāng)所述樣品中不含有石蠟時，所述裂解液包括蛋白酶K和裂解緩沖液；

所述蛋白酶K在反應(yīng)體系中的終濃度為15～20mg/mL；

所述裂解緩沖液的包括如下組分：十二烷基硫酸鈉1％～5％，異硫氰酸胍3～5mol/L，Tris-HCl 10～15mmol/L，EDTA 0.05～0.1mol/L，Triton-X100 0.05％～0.1％；

所述裂解緩沖液的pH為7.8～8.0；

(2)90℃孵育40～45min，室溫靜置后離心，吸取含有核酸的水相溶液；

(3)加入所述修復(fù)液至所述UNG酶的終濃度為10～15U/μL，混勻，在50～55℃孵育1～1.5h，室溫靜置后離心；

(4)在步驟(3)得到的溶液中加入RNA酶至終濃度為150～300mg/mL；室溫靜置處理1～10min；

(5)加入蛋白去除液，將得到的懸液轉(zhuǎn)移至核酸純化柱中，經(jīng)純化得到基因組DNA；

所述蛋白去除液包括如下組分：45～75mmol/L Tris-HCl，100～120mmol/L NaCl，30～60mmol/L乙二胺四乙酸二鈉，無水乙醇75％～95％。

10.根據(jù)權(quán)利要求1～9任一項所述的方法，其特征在于，所述樣品為保存的動物樣品；優(yōu)選為經(jīng)福爾馬林固定或經(jīng)石蠟包埋的動物樣品。