[發明專利]一種對映選擇性提高的宇佐美曲霉環氧化物水解酶突變體

有效

• 申請號: 201811633720.6
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109609479B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 鄔敏辰;蘇永君;王婷婷;徐雄峰;文正;胡博淳;胡蝶;李劍芳
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/14
• 分類號: C12N9/14;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P41/00;C12P7/22
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種對映選擇性提高的宇佐美曲霉環氧化物水解酶突變體，屬于酶工程和生物催化技術領域。本發明基于理性設計對宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)環氧化物水解酶(AuEH2)進行分子改造，結合基因的定點飽和突變方法，獲得多個對映選擇性提高的環氧化物水解酶突變體。本發明獲得的9個對映選擇性提高的突變體催化外消旋對甲基苯基縮水甘油醚(rac?pMPGE)的對映體比率(E值)相比野生型，從12.7分別提高至32.4、31.1、27.8、25.8、23.5、22.4、20.2、14.1、13.6。

技術領域

本發明涉及一種對映選擇性提高的宇佐美曲霉環氧化物水解酶突變體，屬于酶工程和生物催化技術領域。

背景技術

手性環氧化物和鄰二醇是合成手性藥物、農業、香料及精細化工等行業各種活性物質的重要中間體，具有廣闊的應用前景和市場需求。光活性的手性化合物具有不同于外消旋體的獨特性質，其在生物體內的代謝途徑、代謝速率、藥理及毒性等方面的差異，使其在化學和生命科學產業有著嶄新和特殊的用途。20世紀60年代，震驚世界的“反應停事件”已經充分說明獲得光學純化合物的必要性。傳統的化學法拆分環氧化物往往需要重金屬類有毒物質作為催化劑，不僅面臨著環境的巨大挑戰，且很難獲得高產率的手性純化合物。環氧化物水解酶(Epoxide hydrolases,EHs)是一類催化水分子立體選擇性的加成環氧化物水解為相應1,2- 二醇的水解酶類，是一種典型α/β折疊型水解酶。然而，不同來源的EHs的性質均存在很大的差異，自然界篩選到的具有EHs活性的微生物往往存在產酶活低、對映選擇性較低及穩定性差等缺陷，往往不能滿足工業化應用的需求。

目前，研究較多的微生物EH主要來自于黑曲霉(Aspergillus niger)、黏紅酵母(Rhodotorula glutinis)、放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter AD1)、鞘氨醇單胞菌屬 (Sphingomonas sp.)和芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，這些EH對一些特定的底物具有較高的催化活性和高對映選擇性。近年來，分子生物學技術，如定點突變、飽和突變、錯易PCR和DNA shuffling等也用于改造EHs的催化活性、穩定性、對映選擇性等性質，并通過高通量篩選獲得優良突變酶。

目前已有宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)來源的環氧化物水解酶(AuEH2)在大腸桿菌E. coli BL21(DE3)中實現異源表達的技術方案(公開于公開號CN102994470A的專利申請中)，該環氧化物水解酶可對映選擇性水解動力學催化多種環氧化物制備高光學純的手性環氧化物 (J Ind Microbiol Biotechnol,2015，42(5):671-680)。但該重組酶對環氧化物的對映選擇性并不高，從而限制了其在高附加值藥物前體的手性合成中的應用潛力。

發明內容

針對現有技術存在的上述缺陷，本發明要解決的第一個技術問題是提供一種對映選擇性提高的環氧化物水解酶(AuEH2)突變體，所述突變體是(a)或(b)：

(a)在SEQ ID NO.1所示序列基礎上，將第250位丙氨酸(A)突變為組氨酸(H)、精氨酸(R)、甘氨酸(G)、賴氨酸(K)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、或脯氨酸(P)；

(b)在(a)限定的氨基酸序列中經過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有環氧化物水解酶活性的由(a)衍生的蛋白質。

本發明的第二個目的是提供編碼所述突變體的基因。

本發明的第三個目的是提供攜帶所述基因的載體或細胞。

本發明的第四個目的是提供一種表達所述AuEH2突變體的基因工程菌，以pET系列質粒為載體，以大腸桿菌為宿主，表達所述環氧化物水解酶突變體。

在本發明的一種實施方式中，所述表達宿主是E.coli BL21(DE3)。