[發明專利]引物組合及其在豬的種屬鑒定和/或豬肉鑒定中的應用

在審

• 申請號: 201811631623.3
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN109706250A
• 公開（公告）日: 2019-05-03
• 發明（設計）人: 張巖;陳燕旌;邢婉麗;蔡美靜;程京
• 申請（專利權）人: 博奧生物集團有限公司
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 張柳;趙青朵

本發明涉及生物技術領域，特別涉及引物組合及其在豬的種屬鑒定和/或豬肉鑒定中的應用。本發明提供了靈敏度高、特異性強、重復性好的LAMP恒溫擴增引物，比現有技術中提供的引物性能更優異。本發明的優點在于高效、簡便、快速、結果可實時觀測的特點，從樣品的處理到報告結果只需1h，后期可以適應簡單的實驗條件或現場實時檢測的需求。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，特別涉及引物組合及其在豬的種屬鑒定和/或豬肉鑒定中的應用。

背景技術

肉是我們人類優質蛋白質和多種營養素的主要來源，含有豐富的必須氨基酸和多種微量元素。近年來，隨著我國居民生活水平的提高，僅國內生產的肉類遠不能滿足市場需求，需要從國外進口部分肉類。這些因素為國內外不法商販乘虛而入創造了條件，在市場上肉的摻假和欺詐行為也越來越受到人們的關注。其中，豬肉以其鮮美的口感和實惠的價格受到許多消費者的喜愛。但同時，豬肉也常常被用作摻假肉來冒充一些名為魚丸、牛肉丸和羊肉串等半加工食品，且這種情況比比皆是。所以，為了保障消費者合法權益，確立有效的肉源性成份鑒定方法是十分必要。

對于現今社會而言，傳統的依靠感官和經驗的肉類形態鑒別方法已經不能滿足市場對肉制品摻假現象進行控制監管的需要。目前對肉類產品的鑒定方法主要在蛋白質和核酸水平進行。在蛋白質水平，常用ELISA和高效液相色譜等技術進行檢測，其局限性在于對儀器、試劑和樣品處理要求高，且檢測加工樣品時特異性和準確性較差，費時費力。相對來說，檢測核酸的方式更方便準確。在核酸水平，常用的核酸水平檢測技術有PCR與實時熒光PCR。PCR技術是目前最常用的檢測肉源性成分的方法，因為其具有較高的靈敏度、特異性和可操作性。但一般的PCR反應至少1.5h，且后期檢測需要使用基因測序和凝膠電泳，而凝膠電泳中的EB具有強致癌性，具有一定的安全隱患。而實時熒光PCR需要昂貴的儀器及試劑，且反應時間至少1.5h，且對操作人員有較高要求，難以在基層得以推廣。

現有技術公開了檢測豬肉的LAMP引物，該引物在總反應時間60min內檢測出的極限為500fg的核酸，其使用的可視化法是在反應結束后，觀察反應后的體系是否變渾濁，這種方法雖然簡便，但由于個體差異和沒有標準的判讀范圍，很容易在結果判讀時造成假陽或假陰的結果誤判。另一種可視化方法是在反應后開蓋加入染料使其顯色，這個過程中極其容易造成產物污染，導致其他檢測指標出現假陽性現象。而本發明中提到的檢測豬肉的LAMP引物，在總反應時間50min內即能檢測到200fg的核酸，且使用熒光法LAMP進行檢測，可以實時觀察結果，避免了造成污染的風險。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了特異性強，且能準確鑒定樣品中豬肉的特異性LAMP引物組，和利用該引物組建立的檢測方法。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了線粒體Cox1基因在豬的種屬鑒定和/或豬肉鑒定中的應用。

本發明還提供了一種標志物，具有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。

在此基礎上，本發明提供了具有如SEQ ID NO:7所示序列的核苷酸作為標志物在豬的種屬鑒定和/或豬肉鑒定中的應用。

在上述研究的基礎上，本發明還提供了引物組合，包括：引物-F3、引物-B3、引物-FIP、引物-BIP、引物-LF和引物-LB；

所述引物-F3具有如下所示的核苷酸序列中的任意一項：

(I)、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；

(II)、具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列經修飾、取代、缺失和/或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列；

(III)、與SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列具有至少80％同源性的序列；

(IV)、如(I)、(II)或(III)所示序列的互補序列；