[發明專利]檢測SLC28A3基因rs885004位點多態性的人工模擬核酸分子信標與試劑盒

在審

• 申請號: 201811629101.X
• 申請日: 2018-12-29
• 公開（公告）號: CN111378750A
• 公開（公告）日: 2020-07-07
• 發明（設計）人: 葛猛;潘世讓;余倩;杜柏均;王宏偉
• 申請（專利權）人: 北京福安華生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種SLC28A3基因rs885004位點多態性的分型檢測方法與試劑盒。本發明采用SLC28A3基因特異性的引物SEQ1和SEQ2擴增SLC28A3基因片段，同時在SLC28A3基因特異性的引物界定的擴增區域內設計SLC28A3基因特異性人工模擬核酸分子信標SEQ3?FAM和SEQ4?VIC。本發明提供的基于基因特異性PCR結合人工模擬核酸分子信標判斷SLC28A3基因rs885004位點多態性的方法不僅準確率高，而且還具有檢測速度快、操作簡單、結果判讀客觀、閉管反應污染少等優點，非常適合于在臨床中大規模開展。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及SLC28A3基因rs885004位點多態性的分型檢測方法與試劑盒。

背景技術

兒童期癌癥是針對于兒童的癌癥，近年來兒童癌癥發病率正在逐漸增加。兒童癌癥治療方法的改進在過去幾十年中大大提高了存活率，目前已超過80%。然而，長期治療過程產生的并發癥造成了大量患兒發病和死亡，尤其是心血管并發癥和充血性心力衰竭。其中，蒽環類藥物治療是導致心血管病風險增加和心臟功能不全的主要原因之一。蒽環類藥物誘導的心臟毒性（ACT）可表現為無癥狀的超聲心電圖異常或者是需要治療的臨床心力衰竭。已經確定了許多與ACT相關的臨床風險因素，最重要的是ACT的發作呈現出劑量依賴性，累積用藥劑量越高，發生ACT的風險就越大。

遺傳因素也與ACT的發病相關。SLC28A3編碼濃縮核苷轉運蛋白，調節多種細胞過程，包括神經傳遞、血管張力、細胞表面受體附近的腺苷濃度以及核苷類藥物的轉運與代謝。SLC28A3基因中的rs885004（A/G）與ACT顯著相關。進一步鑒定這些遺傳風險因素可能會使ACT的低風險和高風險患者得到更好的分組，從而改善治療和監測方案，提高癌癥治療的安全性，同時不影響生存。

目前，基因多態性檢測的方法主要有PCR-Sanger測序法、芯片雜交法、高分辨率溶解曲線法等。這些方法雖然都可以在一定程度上檢測基因多態性，但都有不可忽視的局限性。Sanger測序法步驟較多，需要PCR后處理，不僅操作繁瑣，還易產生污染，并不能滿足臨床的需求。芯片雜交法操作繁瑣，其檢測還依賴于昂貴的設備儀器，導致成本較高。高分辨率溶解曲線法對儀器要求高，需要具有安裝高分辨率軟件、溫度比較敏感的機器才能使用，臨床推廣存在困難。基于Taqman水解探針的熒光定量PCR，利用Taq酶的外切酶活性，切斷探針產生熒光信號，由于Taqman探針熒光基團與淬滅基團并不緊密靠近，導致熒光淬滅不徹底，存在背景熒光信號。此外，Taqman探針對于單堿基錯配識別能力較差，極易生成非特異熒光信號，干擾結果判讀，進而影響檢測的準確性。因此，臨床上迫切需要一種簡便易行、靈敏度高、準確可靠的檢測基因多態性的方法。

分子信標（Molecular Beacon）在空間結構上呈發夾型，由環狀區和莖干區組成，環狀區與靶DNA序列互補，長約15-35個核苷酸，莖桿區長約5-7個核苷酸，由GC含量較高的與靶序列無關的互補序列構成，分子信標的5′端標記熒光基團（F），3′端標記淬滅基團（Q）。對于分子信標來說，自由狀態時，熒光基團與淬滅基團靠近（約為7-10nm）。此時發生熒光共振能量轉移，使熒光基團發出的熒光被淬滅基團吸收并以熱的形式散發，熒光幾乎完全被淬滅，熒光本底極低。當分子信標的環狀區與序列完全互補的靶DNA雜交形成雙鏈雜交體時，分子信標莖桿區被拉開，熒光基團和淬滅基團距離增大。根據Foerster理論，中心熒光能量轉移效率與兩者距離的6次方成反比，因此，雜交后分子信標的熒光幾乎100%恢復，且所檢測到的熒光強度與溶液中靶DNA的量成正比（圖1）。因此，理想的分子信標比Taqman水解探針更為高效。然而，由于分子信標中與靶序列無關的莖桿區的引入導致分子信標與模板序列之間常會產生一些非特異性相互作用，從而導致背景信號增強，進而影響檢測效率。而要消除這種背景信號，就會對分子信標的設計尤其是莖桿區的序列設計產生很高的要求。此外，研究顯示分子信標在環狀區序列較短時，用于檢測基因突變（包括單堿基的錯配、缺失或插入突變）效果較好，但實際上，很多時候，由于特定靶序列區的GC含量較低，往往會導致環狀區序列過長，從而影響檢測效率。因此，得到一個理想的分子信標往往比較困難。