[發明專利]一種胞內PB基因殘留檢測的方法及檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201811624459.3
• 申請日: 2018-12-28
• 公開（公告）號: CN111378651A
• 公開（公告）日: 2020-07-07
• 發明（設計）人: 金華君;郝方元;張喜艷;經熒萍;劉相岑;錢其軍
• 申請（專利權）人: 上海細胞治療集團有限公司;上海細胞治療研究院
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6851;C12Q1/6886
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

1.引物對組合，其包含以下引物對中的引物對1和選自引物對2、3和4中的任意一個、兩個或三個：

引物對1，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物對；

引物對2，SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示的引物對；

引物對3，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的引物對；

引物對4，SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的引物對。

2.探針或探針組合，其包含以下探針中的任意一個、兩個或三個：

探針A，其核酸序列如SEQ ID NO:3所示；

探針B，其核酸序列如SEQ ID NO:4所示；

探針C，其核酸序列如SEQ ID NO：5所示。

3.根據權利要求2所述的探針或探針組合，其中，所述探針的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團；優選地，所述熒光報告基團選自FAM、Hex、VIC、ROX和Cy5；優選地，所述熒光淬滅基團選自BHQ1、TAMRA、JOE、BHQ2和BHQ3。

4.根據權利要求2或3所述的探針或探針組合，其中，

探針A和/或探針B中的一個或多個位置的堿基被鎖核酸修飾。

5.根據權利要求4所述的探針或探針組合，其中，

探針A的5’端起第4位、第7位、和第10位中的任意1個、2個、或3個堿基被鎖核酸修飾。

6.一種試劑盒，其包含權利要求1所述的引物對組合，和/或權利要求2至5中任一權利要求所述的探針或探針組合。

7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于，其還包含PCR反應所需的試劑，優選地，所述PCR反應所需的試劑選自Mg²⁺、反應緩沖液、dNTP和DNA聚合酶中的一種或多種。

8.一種測定CAR-T細胞治療殘留質粒拷貝數的方法，包括如下步驟：

(1)提取待測樣品的DNA；

(2)使用含PB骨架基因的CAR質粒和含Actin基因的質粒作為標準品母液，分別制成CAR質粒基因標準品系列和Actin標準品系列；

(3)使用權利要求1的引物對組合和/或權利要求2-5所述的探針或探針組合和/或權利要求6-8所述的試劑盒，分別對PB基因CAR質粒標準品系列、Actin標準品系列和待測樣品的DNA進行實時熒光定量PCR；

(4)根據每個含PB基因CAR質粒標準品系列產生的Ct值與對應拷貝數，含Actin標準品系列產生的Ct值與對應拷貝數，分別繪制標準曲線，獲得計算公式；

(5)將待測樣品的PB基因和Actin基因的Ct值帶入步驟(4)中的標準曲線的計算公式，獲得待測樣品的PB基因拷貝數和Actin拷貝數；

優選地，步驟(1)中的待測樣品為含PB基因CAR質粒轉導過的細胞；

優選地，步驟(2)中的梯度稀釋為10倍梯度稀釋；

優選地，步驟(3)中所述實時熒光定量PCR的擴增反應的條件為：94℃5min；94℃20s，60℃1min，共40個循環。

9.一種對CAR質粒殘留量進行檢測的方法，包括下述步驟：

A.測定PB基因的拷貝數，

B.評估質粒殘留量或與免疫治療要求的殘留外源基因拷貝數進行比較；

其中，步驟A中所述測定PB基因拷貝數采用根據權利要求8所述的測定PB基因拷貝數的方法；

所述CAR質粒含有PB骨架基因。

10.權利要求1所述的引物對組合和/或權利要求2至3中任一權利要求所述的探針或探針組合在制備用于測定CAR質粒拷貝數的藥物或者制備用于對CAR質粒殘留進行質量控制的藥物中的用途，其中所述CAR質粒含有PB骨架基因。