[發(fā)明專利]一種含有人工標(biāo)簽的雜交探針

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811624332.1
• 申請日: 2018-12-28
• 公開（公告）號: CN109652521A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃劭;宋方麗;張家劍;方健
• 申請（專利權(quán)）人: 黃劭
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876
• 代理公司: 廣東良馬律師事務(wù)所 44395
• 代理人: 李良

本發(fā)明公開了一種含有人工標(biāo)簽的雜交探針。本發(fā)明通過在傳統(tǒng)的兩條雜交探針(上游探針和下游探針)基礎(chǔ)上引入新的不與擴增區(qū)域雜交的人工標(biāo)簽序列，并使用額外的專門與人工標(biāo)簽區(qū)域雜交的探針提供熒光供體或受體基團(tuán)。因為人工標(biāo)簽序列雜交區(qū)域的Tm值低于前兩條雜交探針與擴增區(qū)域雜交部分的Tm值，因此整個體系的Tm值僅由人工標(biāo)簽部分的Tm值決定，從而使熔解曲線分析時的Tm值保持恒定，不受擴增區(qū)域SNP、缺失、插入等突變的影響。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種含有人工標(biāo)簽的雜交探針。

背景技術(shù)：

當(dāng)一個熒光分子(又稱為供體分子)的熒光光譜與另一個熒光分子(又稱為受體分子)的激發(fā)光譜相重疊時，供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子發(fā)出熒光，同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減，這種現(xiàn)象稱為熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)現(xiàn)象。FRET程度與供、受體分子的空間距離緊密相關(guān)，一般為7～10nm時即可發(fā)生FRET，隨著距離延長，F(xiàn)RET呈顯著減弱。

FRET雜交探針可用于對待測序列進(jìn)行檢測(Matthews,JA AnalyticalBiochemistry 169(1988)1-25)，其特征為同時使用與待測序列同一鏈互補相鄰位點互補的兩個單鏈雜交探針對，兩個探針用不同熒光成分標(biāo)記，當(dāng)特定波長激發(fā)時，第一種成分(供體)將吸收的能量轉(zhuǎn)移到第二種成分(受體)上，通過檢測第二種成分的熒光發(fā)射量對待測序列的量進(jìn)行檢測。當(dāng)退火到靶序列時，雜交探針之間必須非常接近，通常第一個探針標(biāo)記的3`端和第二個探針的5`端間隙為1-5個堿基，約10-100埃。

除進(jìn)行實時PCR外，F(xiàn)RET雜交探針還可用于熔解曲線分析，當(dāng)雜交探針結(jié)合到靶序列上時，受體基團(tuán)通過FRET原理發(fā)射出熒光，在解鏈溫度時，雜交探針從靶序列上脫離，受體基團(tuán)的熒光信號降低，通過求導(dǎo)觀察熒光信號降低的最大值來判讀熔解溫度(Tm)值，通過Tm值來判斷雜交序列是否是目標(biāo)序列。

FRET雜交探針一般使用兩條分別攜帶供體基團(tuán)和受體基團(tuán)的探針順序雜交在擴增區(qū)域的鄰近部位，而熔解曲線的Tm值則由這兩條探針本身的雜交序列決定(一般是取決于Tm值較低的那條，因為Tm值較低的相比Tm值較高的先脫落下來)，當(dāng)雜交區(qū)域出現(xiàn)SNP、缺失、插入等突變時，便會造成Tm值的變化，影響結(jié)果判讀。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種不受擴增區(qū)域SNP、缺失、插入等突變的影響，能使熔解曲線分析時的Tm值保持恒定的含有人工標(biāo)簽的雜交探針。

本發(fā)明的含有人工標(biāo)簽的雜交探針，包括上游探針和下游探針，其特征在于，包括：

a、在上游探針的3’端連有熒光受體基團(tuán)或熒光供體基團(tuán)，在下游探針的5’端連有人工標(biāo)簽序列，還含有第三探針，所述的第三探針是與人工標(biāo)簽序列雜交的探針，第三探針的5’端連有熒光供體基團(tuán)或熒光受體基團(tuán)，所述的人工標(biāo)簽序列不與上游探針、下游探針和擴增模板雜交，人工標(biāo)簽序列雜交區(qū)域的Tm值低于上游探針和下游探針與擴增區(qū)域雜交部分的Tm值；

或b、在上游探針的3’端連有人工標(biāo)簽序列，在下游探針的5’端連有熒光受體基團(tuán)或熒光供體基團(tuán)，還含有第三探針，所述的第三探針是與人工標(biāo)簽序列雜交的探針，第三探針的5’端連有熒光供體基團(tuán)或熒光受體基團(tuán)，所述的人工標(biāo)簽序列不與上游探針、下游探針和擴增模板雜交，人工標(biāo)簽序列雜交區(qū)域的Tm值低于上游探針和下游探針與擴增區(qū)域雜交部分的Tm值；

或c、在上游探針的3’端連有第一人工標(biāo)簽序列，在下游探針的5’端連有第二人工標(biāo)簽序列，還包括有第三探針和第四探針，所述的第三探針與第一人工標(biāo)簽序列雜交，所述的第四探針與第二人工標(biāo)簽序列雜交，在第三探針的3’端連有熒光受體基團(tuán)或熒光供體基團(tuán)，在第四探針的5’端連有熒光供體基團(tuán)或熒光受體基團(tuán)，所述的第一人工標(biāo)簽序列和第二人工標(biāo)簽序列不與上游探針、下游探針和擴增模板雜交，第一人工標(biāo)簽序列和第二人工標(biāo)簽序列互相不雜交，第一人工標(biāo)簽序列或第二人工標(biāo)簽序列雜交區(qū)域的Tm值低于上游探針和下游探針與擴增區(qū)域雜交部分的Tm值。