[發明專利]一種胎盤間充質干細胞微囊粉的制備方法

在審

• 申請號: 201811622245.2
• 申請日: 2018-12-28
• 公開（公告）號: CN109619561A
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 周麗英;袁衛平;汪曉敏;呂為;萬謙
• 申請（專利權）人: 溯源生命科技股份有限公司
• 主分類號: A23L33/00
• 分類號: A23L33/00;A23L3/00;A23P10/30;C12N5/0775
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 陳娟

1.一種胎盤間充質干細胞微囊粉的制備方法，其特征在于它包含如下步驟：

一、選取足月順產或剖宮產的盤狀胎盤，剪取胎盤底蛻膜面的組織；

二、在無菌室挑取顏色鮮亮的組織，剪成肉泥；

三、將剪碎的組織用細胞刮刀平鋪于T75cm²的細胞培養瓶中，做好標記；

四、將細胞培養瓶倒扣，緩慢加入無血清培養基，放入37℃培養箱中，向培養箱中充入5％的CO₂，倒置2h，擰緊瓶蓋；

五、將細胞培養瓶正置，確保培養液能覆蓋住每塊組織，靜置培養；

六、三天后觀察組織塊，觀察時動作要輕，盡量不要晃動；

七、七天后再半量換液，此后均半量換液；

八、待細胞匯合度達到80％左右時，進行傳代培養；

九、將培養液去除，生理鹽水沖洗一遍，加入2mL的0.25％Trypsin-EDTA(1X)，放入37℃培養箱中，約3-5min，待細胞變圓時，停止消化，棄去消化液，加入無血清培養基至培養瓶終止消化，輕輕吹打貼壁的細胞，使細胞均勻分布于溶液中，吸取細胞懸浮液到新的離心管中，離心5min，轉速為1500rpm；

十、棄去上層溶液，收集下層沉淀，加入傳代培養基，按著1×105個/mL細胞量進行傳代培養；

十一、待細胞生長至80-90％密度時，收獲細胞；計數，取1×108胎盤間充質干細胞，加入預冷的50mL滅菌去離子水，反復凍融，使細胞充分裂解，其它細胞液氮中冷凍保藏；

十二、根據需要凍存的細胞數，在50mL離心管中加入若干毫升的細胞凍存重懸細胞；

十三、將凍存的細胞均分到若干個2mL的凍存管中，每管加細胞懸液1mL，將凍存管蓋擰緊蓋好；

十四、將凍存管置于已平衡到4℃的程序降溫盒中，移至-80℃冰箱逐級降溫-80℃；

十五、從程序降溫盒中取出凍存管，迅速移至液氮中長期凍存備用；

十六、取第十一步驟中裂解后的細胞混合液，在4℃的溫度下離心10min1轉速為10000rpm；吸取含有活性物質的上清液于新的無菌離心管中，定容至100mL，低溫保存備用；

十七、稱取5g阿拉伯膠及100g去離子水，在60℃水浴中攪拌溶解，得到5％阿拉伯膠壁材溶液；

十八、稱取1g殼聚糖及100g去離子水，在50℃水浴中攪拌溶解，得到1％殼聚糖壁材溶液；

十九、將步驟十六中低溫保存的上清液加入花生油中，上清液與花生油的體積比為1:3，在35℃的溫度下高速分散乳化40min，轉速為10000rpm，得到均一的W/O型乳狀液；

二十、將W/O型乳狀液加入5％阿拉伯膠中，W/O型乳狀液與5％阿拉伯膠的體積為比1:4，在35℃的溫度下高速分散乳化30min1轉速為10000rpm，得到均一的W/O/W型乳狀液；

二十一、將上述W/O/W型乳狀液加入1％殼聚糖中；W/O/W型乳狀液與1％殼聚糖的體積比為1:1，恒溫勻速攪拌條件下，用1mol/LHCl溶液和0.1g/mLNaOH調節PH至4-5；在25℃的溫度下高速分散乳化30min，轉速為10000rpm，使阿拉伯膠與殼聚糖發生復凝聚作用；

二十二、室溫條件下，固化4h；

二十三、真空冷凍干燥機預冷至-45℃后開始抽真空，控制在80Kpa，冷凍時間8h，得到胎盤間充質干細胞微膠囊。

2.根據權利要求1所述的一種胎盤間充質干細胞微囊粉的制備方法，其特征在于步驟四及步驟九中的無血清培養基包含-XF人間充質干細胞基礎培養基和添加物，并充分混合，-XF人間充質干細胞基礎培養基和添加物以10:1的體積比充分混合，混合后加入L-gln，使其終濃度達到2mM。

3.根據權利要求1所述的一種胎盤間充質干細胞微囊粉的制備方法，其特征在于步驟十中的傳代培養基包含完全培養基-XF和MSCGM-CD^TMBulletKit；完全培養基-XF和MSCGM-CD^TMBulletKit的質量比為3:1。

4.根據權利要求1所述的一種胎盤間充質干細胞微囊粉的制備方法，其特征在于步驟十二中，細胞凍存液的添加量為1×107細胞加入1ml凍存液。