[發(fā)明專利]用于表達(dá)外源基因的畢赤酵母突變株

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201811619605.3
• 申請日: 2018-12-28
• 公開（公告）號: CN111378586B
• 公開（公告）日: 2023-04-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹海生;戴小軍;吳偉
• 申請（專利權(quán)）人: 豐益（上海）生物技術(shù)研發(fā)中心有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/16;C12N9/20;C12R1/84
• 代理公司: 上海專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

本發(fā)明提供保藏編號為CGMCC?No.16668的巴斯德畢赤酵母(Pichia?pastoris)菌株。本發(fā)明的菌株可用于構(gòu)建表達(dá)外源基因的畢赤酵母菌，構(gòu)建得到的畢赤酵母菌是有效的外源表達(dá)通用宿主，可高效表達(dá)各種蛋白，尤其是磷脂酶和脂肪酶。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于表達(dá)外源基因的畢赤酵母突變株。

背景技術(shù)

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是20世紀(jì)80年代初期發(fā)展起來的一種新型的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)。由于它既具有原核表達(dá)系統(tǒng)操作簡易、易于培養(yǎng)、生長速度快、表達(dá)量高、成本低等優(yōu)點，還具有原核生物表達(dá)系統(tǒng)所不具有的外源蛋白的翻譯后修飾等特點，如糖基化、蛋白磷酸化等。同時它還避免了釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)分泌效率差、表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定、表達(dá)質(zhì)粒易丟失等缺陷，所以該表達(dá)系統(tǒng)很快成為目前最優(yōu)秀、應(yīng)用最為廣泛的外源基因表達(dá)系統(tǒng)之一。

Koichi?Ogata等人于1969年首次發(fā)現(xiàn)了某些酵母可以利用甲醇為唯一碳源和能源生長(Ogata,et?a1.1969)，此后，用甲醇利用型酵母生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白作為動物飼料的潛力就引起了廣泛關(guān)注。1987年，Cregg等人首次報道了用甲醇營養(yǎng)型酵母表達(dá)乙型肝炎表面抗原(HbsAg)，隨后Philip?Petroleum公司與Salk?Institute?Biotechnology/IndustrialAssociates(SIBIA)就開始了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的合作開發(fā)。SIBIA的研究人員分離了AOX基因的啟動子和宿主菌株，構(gòu)建了載體，并開發(fā)出了相應(yīng)的畢赤酵母基因操作技術(shù)，結(jié)合Philip?Petroleum公司生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白的發(fā)酵工藝，實現(xiàn)了外源蛋白的高效表達(dá)。1993年，Philip?Petroleum公司將畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的專利賣給Research?CorporationTechnologies(RCT)公司。

RCT公司的基礎(chǔ)菌株GS115來自化學(xué)法誘變原始菌NRRL-Y?11430(ATCC?76273)，使之成為組氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主(His-)，便于進(jìn)行克隆篩選。GS115醇氧化酶基因AOX1完整，已經(jīng)能夠很好地利用甲醇表達(dá)大多數(shù)外源蛋白，但其本底AOX1依然會高效表達(dá)，因而某些基因的產(chǎn)量受到影響。后續(xù)畢赤酵母衍生菌株方向之一就是在GS115基礎(chǔ)上將AOX1基因敲除，替換成釀酒酵母ARG4基因，得到KM71(his4?arg4?aox1Δ::ARG4)，其AOX2基因保持完整，因此甲醇利用率很低，在甲醇唯一碳源的培養(yǎng)下生長很慢。進(jìn)一步敲除AOX2基因，得到了無法利用甲醇的宿主MC100-3(his4?arg4?aox1Δ::SARG4?aox2Δ::Phis4)。在GS115基礎(chǔ)上改造的另一個方向是失活宿主蛋白酶。敲除畢赤酵母液泡蛋白酶B(Proteinase?B，prb1)，得到SMD1165(his4?prb1)?；蚯贸号萏於彼岬鞍酌?PEP4)得到SMD1168(his4pep4)，該蛋白酶用于激活其他液泡蛋白酶，包括羧肽酶Y(carboxypeptidase?Y)和蛋白酶B。然后在SMD1168基礎(chǔ)上進(jìn)一步敲除液泡蛋白酶B(Proteinase?B，prb1)，得到SMD1163(his4?pep4?prb1)。即PEP4蛋白酶比較關(guān)鍵，用于一些蛋白酶的活化，必要時可進(jìn)一步敲除液泡蛋白酶prb1和羧肽酶。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明改造畢赤酵母CICC32806，得到可以高效外源表達(dá)各種蛋白，尤其是磷脂酶、脂肪酶的畢赤酵母菌。

具體而言，本發(fā)明提供保藏編號為CGMCC?No.16668的巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)菌株。

本發(fā)明提供一種基因工程化的畢赤酵母菌株，該菌株為經(jīng)基因工程改造而含有外源基因或該外源基因的載體的保藏編號為CGMCC?No.16668的巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)菌株。

在一個或多個實施方案中，所述菌株的基因組中整合了所述外源基因。

在一個或多個實施方案中，所述外源基因為工業(yè)、飼料或食品領(lǐng)域中用到的蛋白的編碼序列。