[發明專利]用于表達外源基因的畢赤酵母突變株

有效

• 申請號: 201811619556.3
• 申請日: 2018-12-28
• 公開（公告）號: CN111378585B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發明（設計）人: 吳偉;戴小軍;曹海生;周美鳳;牛其文
• 申請（專利權）人: 豐益（上海）生物技術研發中心有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N9/18;C12N9/20;C12N9/26;C12N9/40;C12N9/42;C12N9/50;C12N15/81;C11B3/00;C11C3/10;C12R1/84
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

本發明涉及用于表達外源基因的畢赤酵母突變株。具體而言，本發明涉及保藏編號為CGMCC?No.16670的巴斯德畢赤酵母菌株。本發明的畢赤酵母突變株是有效的外源表達通用宿主，可高效表達各種蛋白，尤其是磷脂酶和脂肪酶。

技術領域

本發明涉及用于表達外源基因的畢赤酵母突變株。

背景技術

巴斯德畢赤酵母表達系統是20世紀80年代初期發展起來的一種新型的外源蛋白表達系統。由于它既具有原核表達系統操作簡易、易于培養、生長速度快、表達量高、成本低等優點，還具有原核生物表達系統所不具有的外源蛋白的翻譯后修飾等特點，如糖基化、蛋白磷酸化等。同時它還避免了釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)分泌效率差、表達菌株不夠穩定、表達質粒易丟失等缺陷，所以該表達系統很快成為目前最優秀、應用最為廣泛的外源基因表達系統之一。

Koichi?Ogata等人于1969年首次發現了某些酵母可以利用甲醇為唯一碳源和能源生長(Ogata,et?a1.1969)，此后，用甲醇利用型酵母生產單細胞蛋白作為動物飼料的潛力就引起了廣泛關注。1987年，Cregg等人首次報道了用甲醇營養型酵母表達乙型肝炎表面抗原(HbsAg)，隨后Philip?Petroleum公司與Salk?Institute?Biotechnology/IndustrialAssociates(SIBIA)就開始了畢赤酵母表達系統的合作開發。SIBIA的研究人員分離了AOX基因的啟動子和宿主菌株，構建了載體，并開發出了相應的畢赤酵母基因操作技術，結合Philip?Petroleum公司生產單細胞蛋白的發酵工藝，實現了外源蛋白的高效表達。1993年，Philip?Petroleum公司將畢赤酵母表達系統的專利賣給Research?CorporationTechnologies(RCT)公司。

RCT公司的基礎菌株GS115來自化學法誘變原始菌NRRL-Y?11430(ATCC?76273)，使之成為組氨酸營養缺陷型宿主(His-)，便于進行克隆篩選。GS115醇氧化酶基因AOX1完整，已經能夠很好地利用甲醇表達大多數外源蛋白，但其本底AOX1依然會高效表達，因而某些基因的產量受到影響。后續畢赤酵母衍生菌株方向之一就是在GS115基礎上將AOX1基因敲除，替換成釀酒酵母ARG4基因，得到KM71(his4?arg4?aox1Δ::ARG4)，其AOX2基因保持完整，因此甲醇利用率很低，在甲醇唯一碳源的培養下生長很慢。進一步敲除AOX2基因，得到了無法利用甲醇的宿主MC100-3(his4?arg4?aox1Δ::SARG4?aox2Δ::Phis4)。在GS115基礎上改造的另一個方向是失活宿主蛋白酶。敲除畢赤酵母液泡蛋白酶B(Proteinase?B，prb1)，得到SMD1165(his4?prb1)。或敲除液泡天冬氨酸蛋白酶(PEP4)得到SMD1168(his4pep4)，該蛋白酶用于激活其他液泡蛋白酶，包括羧肽酶Y(carboxypeptidase?Y)和蛋白酶B。然后在SMD1168基礎上進一步敲除液泡蛋白酶B(Proteinase?B，prb1)，得到SMD1163(his4?pep4?prb1)。即PEP4蛋白酶比較關鍵，用于一些蛋白酶的活化，必要時可進一步敲除液泡蛋白酶prb1和羧肽酶。

發明內容

本發明改造畢赤酵母CICC32806，得到可用于高效外源表達各種蛋白，尤其是磷脂酶、脂肪酶的畢赤酵母菌。

具體而言，本發明提供保藏編號為CGMCC?No.16670的巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)菌株。

本發明還提供一種基因工程改造的畢赤酵母菌株，該畢赤酵母菌株為經基因工程改造的保藏編號為CGMCC?No.16670巴斯德畢赤酵母菌株，且(a)為組氨酸和尿嘧啶雙缺陷型菌株；和/或(b)含有表達生長促進因子的質粒、和/或基因組中整合有生長促進因子的編碼序列、和/或表達生長促進因子。

在一個或多個實施方案中，所述基因工程改造的畢赤酵母菌株為保藏編號為CGMCC?No.16669的巴斯德畢赤酵母菌株。