[發明專利]一種交聯酶聚體的制備方法

有效

• 申請號: 201811618116.6
• 申請日: 2018-12-28
• 公開（公告）號: CN109735525B
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發明（設計）人: 錢俊青;陳彥;丁靜;郭輝
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N11/00
• 分類號: C12N11/00
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種交聯酶聚體的制備方法，所述為：將酶水溶液調節pH至2.5?4.5，加入丙酮或乙醇，攪拌均勻后，室溫靜置1?3h，排出酶水溶液與丙酮或乙醇總體積50?70％的上清液后，在60?100轉/分鐘攪拌下加入磷酸鹽水溶液，繼續攪拌20?40分鐘，室溫靜置1.5?3.5小時，過濾，濾液與排出的上清液合并后蒸餾回收丙酮或乙醇；濾餅用去離子水洗滌，然后真空干燥，得到交聯酶聚體；本發明方法制備得到的交聯酶聚體酶活回收率達到94.3?97.6％，比現有方法提高27?36％；在45℃水中90分鐘，酶活力保持率達到84.3?88.7％，比游離酶酶活力保持率提高126.6?158.6％。

(一)技術領域

本發明涉及一種交聯酶聚體的制備方法，特別一種以磷酸鹽為交聯劑的交聯酶聚體的制備方法。

(二)背景技術

2000年荷蘭Delfe大學的Sheldondx提出一種酶的制劑新方法，在酶的水溶液中加入硫酸銨或乙醇沉淀酶蛋白，分離出酶蛋白后加入交聯劑戊二醛水溶劑，制備得到酶聚集體。這種新型的酶制劑制備成本低，酶活穩定性高，耐熱，耐有機溶劑，耐酸堿的性能均優于游離酶，可多次重復使用，成為開發的熱點。近20年來，許多酶種均研制了酶聚集體，但是在制備中發現，以戊二醛作為交聯劑，共價交聯酶蛋白，制得的酶聚集體雖然機械強度較好，但戊二醛交聯酶活力損失較大。一方面戊二醛分子尺寸小，可進入酶聚集體內部交聯酶活性位點的基團，另一方面共價交聯使酶聚集體比較緊密，阻礙部分酶活性位點。為此，國內外科技人員也探索了乙二醇雙(N，N-羥基琥珀酰亞胺)作為交聯劑，將瓊脂，殼聚糖，葡聚糖，阿拉伯膠用高碘酸鉀氧化，得到兩個或多個交聯基團，作為酶的交聯劑，這些交聯劑與酶蛋白的交聯機理與戊二醛相似，只是分子尺寸變大，對酶活影響減少，但交聯緊密依然影響酶活。采用磷酸鹽作為酶蛋白交聯劑，是磷酸根與酶蛋白的氨基、羥基之間的離子交聯，磷酸鹽分子尺寸較小，可以與酶聚集體內部的基團交聯，形成的酶聚集體較穩定，仍保持聚集體的優點。而離子交聯的強度明顯低于共價交聯，因而可較好的避免共價交聯影響酶活性位點基團及交聯緊密阻礙酶活的問題，使制備的酶聚集體活力保持更好。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種以磷酸鹽為交聯劑，以離子交聯方式制備的交聯酶聚集體，與國內外現有制備方法比較，可更好的保持酶催化活力，并具有酶聚集體的相應優點。磷酸鹽作為交聯劑的酶聚集體，用于食品加工，安全性有保障。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種交聯酶聚體的制備方法，所述方法為：將酶水溶液調節pH至2.5-4.5，加入丙酮或乙醇，攪拌均勻后，室溫靜置1-3h，排出酶水溶液與丙酮或乙醇總體積50-70％的上清液后，在60-100轉/分鐘攪拌下加入磷酸鹽水溶液，繼續攪拌20-40分鐘，室溫靜置1.5-3.5小時，過濾，濾液與排出的上清液合并后蒸餾回收丙酮或乙醇；濾餅用去離子水洗滌(優選3次)，然后真空干燥(優選在0.1大氣壓真空烘箱中45℃干燥3小時)，得到交聯酶聚體；所述丙酮或乙醇體積用量以酶水溶液體積比為2-4:1；所述磷酸鹽水溶液中磷酸鹽與酶水溶液中酶的重量比為2～65：1。

進一步，所述酶水溶液濃度為1.0-20mg/mL，優選用0.5M磷酸調節酶液的pH至2.5-4.5。

進一步，所述乙醇優選體積濃度95％乙醇水溶液。

進一步，所述酶為脂肪酶或蛋白酶，更優選黑曲霉脂肪酶(深圳綠微康生物工程有限公司生產，30萬單位/克)、假絲酵母脂肪酶(北京凱泰新世紀生物技術有限公司生產，13萬單位/克)、中性蛋白酶(山東巨榮生物工程有限公司生產，5-20萬單位/克，南寧東恒華道生物科技有限公司生產，20萬單位/克)。